L'apprentissage multisensoriel lie les neurones en une croix

Nature volume 617, pages 777–784 (2023)Citer cet article

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Associer plusieurs signaux sensoriels aux objets et à l'expérience est un processus cérébral fondamental qui améliore la reconnaissance des objets et les performances de la mémoire. Cependant, les mécanismes neuronaux qui lient les caractéristiques sensorielles pendant l'apprentissage et augmentent l'expression de la mémoire sont inconnus. Ici, nous démontrons la mémoire appétitive et aversive multisensorielle chez la drosophile. La combinaison des couleurs et des odeurs a amélioré les performances de la mémoire, même lorsque chaque modalité sensorielle a été testée seule. Le contrôle temporel de la fonction neuronale a révélé que les cellules Kenyon (KC) du corps de champignon visuellement sélectives étaient nécessaires pour l'amélioration de la mémoire visuelle et olfactive après un entraînement multisensoriel. L'imagerie de tension chez les mouches à tête fixe a montré que l'apprentissage multisensoriel lie l'activité entre les flux de KC spécifiques à la modalité, de sorte que l'entrée sensorielle unimodale génère une réponse neuronale multimodale. La liaison se produit entre les régions des axones KC olfactifs et visuels, qui reçoivent un renforcement dopaminergique pertinent pour la valence, et se propage en aval. La dopamine libère localement l'inhibition GABAergique pour permettre à des microcircuits spécifiques dans les neurones sérotoninergiques couvrant KC de fonctionner comme un pont excitateur entre les flux KC précédemment «sélectifs de modalité». La liaison intermodale étend ainsi les KC représentant l'engramme de mémoire pour chaque modalité en ceux représentant l'autre. Cet élargissement de l'engramme améliore les performances de la mémoire après l'apprentissage multisensoriel et permet à une seule caractéristique sensorielle de récupérer la mémoire de l'expérience multimodale.

La vie est une riche expérience multisensorielle pour la plupart des animaux. En conséquence, les systèmes nerveux ont évolué pour utiliser des représentations multisensorielles d'objets, de scènes et d'événements afin de guider plus efficacement le comportement1. Il est largement reconnu que l'apprentissage multisensoriel améliore les performances de la mémoire, des enfants en classe aux rongeurs et insectes dans des expériences de laboratoire contrôlées2,3,4,5. De plus, une caractéristique apparemment universelle et inexpliquée de l'apprentissage multisensoriel est qu'il améliore les performances de la mémoire ultérieure même pour les composants non sensoriels séparés3,5. Des études chez l'homme et d'autres mammifères ont suggéré que l'apprentissage multisensoriel bénéficie des interactions entre les cortex spécifiques à la modalité qui étaient coactifs pendant l'entraînement, et que les sens individuels peuvent réactiver les deux zones lors des tests3,6,7,8,9. De plus, les cellules de différentes régions du cerveau répondent à de multiples signaux sensoriels et les proportions ou les nombres changent après un apprentissage multisensoriel1,10,11,12. Cependant, nous manquons actuellement de compréhension mécaniste détaillée de la façon dont l'apprentissage multisensoriel convertit les neurones d'une modalité sélective à multimodale, et comment l'amélioration des performances de la mémoire multisensorielle et unisensorielle pourrait être soutenue par un tel processus.

Chez la drosophile, des populations uniques de corps de champignon (MB) KC reçoivent des apports dendritiques prédominants et anatomiquement séparés des neurones de projection olfactive ou visuelle (ainsi que des interneurones visuels locaux) et leurs axones se projettent sous forme de flux parallèles dans les lobes MB. Là, les compartiments successifs de l'axe axonal de chaque KC sont recoupés par les présynapses des neurones dopaminergiques (DAN) qui véhiculent les effets renforçateurs des stimuli appétitifs ou aversifs13,14. Le renforcement de la dopamine déprime les synapses entre les KC actifs et les dendrites restreintes aux compartiments des neurones de sortie MB en aval pour coder les mémoires spécifiques à la valence15,16,17.

Pour étudier l'apprentissage multisensoriel chez la drosophile, nous avons adapté le labyrinthe olfactif en T18 afin que les couleurs et les odeurs puissent être présentées ensemble (Fig. 1a). Les mouches privées de nourriture ont été entraînées en leur présentant une couleur et/ou une odeur (stimulus conditionné moins (CS−)), suivies d'une autre couleur et/ou odeur (stimulus conditionné plus (CS+)) associées à une récompense en sucre (Fig. 1a, b). Lorsqu'elles ont été entraînées et testées avec uniquement des couleurs (apprentissage visuel), les mouches n'ont pas montré de préférence apprise significative pour la couleur précédemment appariée au sucre (Fig. 1b – d et Extended Data Fig. 1a). Cependant, la combinaison de couleurs et d'odeurs (protocole congruent) a produit une mémoire robuste et durable, qui a été considérablement améliorée par rapport à celle formée par l'entraînement avec uniquement des odeurs (apprentissage olfactif) (Fig. 1b – d et Extended Data Fig. 1a, b). Si les combinaisons de couleurs et d'odeurs étaient permutées entre l'entraînement et les tests (protocole incongru) (Fig. 1b – d et Extended Data Fig. 1a, b), aucune amélioration de la mémoire n'a été observée. De plus, l'amélioration de la mémoire n'était pas apparente si la même couleur était présentée avec les odeurs CS− et CS+ pendant l'entraînement et les tests (Extended Data Fig. 1c). L'effet d'amélioration de la mémoire de l'apprentissage multisensoriel nécessite donc une relation apprise entre des combinaisons spécifiques de couleurs et d'odeurs. Pour la mémoire mesurée 6 h après l'entraînement, le protocole incongru a révélé une diminution significative des performances par rapport à celle après l'apprentissage olfactif (Fig. 1d), ce qui suggère que les mouches sont en conflit lorsque la contingence couleur-odeur est commutée entre l'entraînement et le test.

a, Appareil pour l'entraînement et les tests multisensoriels (à gauche) et la chronologie expérimentale (à droite). b, Protocoles. Les carrés verts et bleus représentent les couleurs, et les carrés gris clair et foncé représentent les odeurs de 3-octanol (OCT) et de 4-méthylcyclohexanol (MCH). Pour l'apprentissage visuel (V), les couleurs ont été utilisées comme CS+ et CS−. Pour l'apprentissage olfactif (O), les odeurs ont été utilisées comme CS+ et CS−. Pour le protocole congruent (C), les couleurs + les odeurs ont été combinées comme CS + et CS− et les mêmes combinaisons de couleurs + odeurs ont été utilisées pour la formation et les tests. Pour le protocole incongruent (I), les couleurs + les odeurs ont été combinées en tant que CS + et CS−, mais les combinaisons ont été inversées entre la formation et les tests. Pour la récupération olfactive (OR), des combinaisons couleur + odeur ont été utilisées pour l'entraînement, mais seules les odeurs ont été utilisées pour les tests. Pour la récupération visuelle (RV), des combinaisons couleur + odeur ont été utilisées pour l'entraînement, mais seules les couleurs ont été utilisées pour les tests. c, d, chronologies de formation et de test (en haut), et mémoire immédiate (c) et 6 h (d) pour les protocoles V, O, C et I (en bas). e,f, Chronologies (en haut) et entraînement multisensoriel avec couleurs + odeurs testées immédiatement (e) et 6 h (f) après l'entraînement pour chaque modalité individuelle (en bas). Les astérisques indiquent une différence significative (P < 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. Les groupes ont été comparés en utilisant une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test de Tukey (c, d) et un test t bilatéral non apparié (e, f) ; Les valeurs P exactes et les comparaisons sont fournies dans les informations supplémentaires. n = 8 pour V et n = 10 pour O, C et I (c); n = 10 (d); n = 10 (e); et n = 14 pour O et OR et n = 10 pour V et VR (f).

Pour étudier plus avant l'amélioration de la mémoire multimodale, nous avons limité la présentation des signaux multisensoriels à la formation ou aux tests. L'entraînement multisensoriel a amélioré la récupération de la mémoire même lorsque chaque modalité était présentée seule pendant le test (récupération olfactive et récupération visuelle) (Fig. 1e, f). En revanche, la présentation de stimuli multisensoriels uniquement pendant les tests n'a pas facilité la performance (récupération multisensorielle) (Extended Data Fig. 1d). De plus, la plus grande amélioration des performances a été observée lorsque des stimuli multisensoriels ont été utilisés pendant l'entraînement et les tests (Extended Data Fig. 1e). Par conséquent, l'entraînement multisensoriel améliore les performances de la mémoire pour les composants individuels de mémoire de couleur et d'odeur, et la congruence des informations de couleur et d'odeur entre l'entraînement et les tests améliore encore les performances. Bien que nos expériences et ailleurs19 impliquent que les mouches distinguent les couleurs vertes et bleues, nous n'écartons pas une contribution de la teinte et de la luminance.

Les dendrites des populations numériquement plus importantes de KC olfactifs dans les lobes αβ, α′β′ et γ (c'est-à-dire, γ-main (γm KCs)) occupent les principaux calices du MB, tandis que les populations relativement petites de αβ-postérieur (αβp) et γ-dorsale (γd) reçoivent principalement des informations visuelles via dend rites dans les calices accessoires14. Les KC γd étaient auparavant impliqués dans l'apprentissage des couleurs19,20. Nous avons testé les rôles des KC visuels γd et αβp dans l'apprentissage et la mémoire multisensoriels, en utilisant l'expression spécifique aux cellules d'un transgène UAS-Shibirets1 (Shits1), qui code pour une dynamine dominante sensible à la température21. À des températures supérieures à 30 °C, Shits1 bloque le recyclage membranaire et altère ainsi la transmission synaptique, tandis que la fonction peut être restaurée en ramenant les mouches à moins de 29 °C. Le blocage de la sortie des KC γd et αβp pendant les tests à 6 h a supprimé l'amélioration visuelle des performances dans le protocole congruent et supprimé l'interférence de l'incongruence ; dans les deux cas, les performances de la mémoire étaient similaires à celles des mouches testées avec les odeurs seules (Fig. 2a – d et Extended Data Fig. 2a – f). Ces résultats suggèrent que l'activité dans les KC γd et αβp représente la composante visuelle de la mémoire multisensorielle (voir également Données étendues Fig. 2g, h). Le blocage de la sortie des KC γd (mais pas des KC αβp) pendant les tests a également altéré les performances de récupération de la mémoire par les odeurs uniquement chez les mouches entraînées multisensorielles (Fig. 2e, f), bien qu'il n'ait aucun effet sur la récupération de la mémoire chez les mouches entraînées avec uniquement des odeurs22 (Extended Data Fig. 2a, d). Ce résultat inattendu nous a conduit à émettre l'hypothèse que l'apprentissage multisensoriel pourrait élargir la représentation des odeurs pour inclure les KC γd « visuels ».

a, Schéma des KC γd (en haut à gauche) et de la chronologie avec changement de température (ligne pointillée) (en bas à gauche). Le blocage de la sortie des KC γd pendant les tests à l'aide de MB607B-GAL4;UAS-Shits1 dans le protocole congruent est également illustré (à droite). b, Blocage de la sortie des KC γd lors des tests dans le protocole incongru. c, schéma des KC αβp (en haut à gauche) et de la chronologie avec changement de température (en bas à gauche). Le blocage de la sortie des KC αβp pendant les tests à l'aide de c708a-GAL4;UAS-Shits1 dans le protocole congruent est également illustré (à droite). d, Blocage de la sortie des KC αβp pendant le protocole incongru. e, f, Chronologie avec changement de température (en haut) et blocage de la sortie des KC γd (e) et αβp (f) lors des tests de récupération olfactive de la mémoire multisensorielle (en bas). Les astérisques indiquent une différence significative (P < 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. Tous les groupes ont été comparés en utilisant une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey ; Les valeurs P exactes et les comparaisons sont fournies dans les informations supplémentaires. n = 12 (a,b,d,f) et n = 10 (c,e). Voir Données étendues Fig. 2 pour les contrôles.

Pour tester directement les réponses évoquées par les odeurs apprises dans les KC γd après un entraînement multisensoriel, nous avons exprimé le capteur de tension UAS-ASAP2f23 dans les KC γd et effectué une imagerie fonctionnelle à deux photons (Fig. 3a – d et Extended Data Fig. 3a, b, f, g). Les mouches ont reçu un entraînement multisensoriel (couleur + odeur), unisensoriel (odeur) ou non apparié (sucre présenté 2 min après couleur + odeur). Six heures après l'entraînement, les mouches ont été imagées pour les réponses olfactives CS + et CS−. Des enregistrements d'axones γd KC ont été effectués dans le compartiment terminal γ5 du lobe horizontal MB, car les DAN récompensant le sucre entraînent une dépression présynaptique pertinente pour l'apprentissage des synapses des neurones de sortie KC – MB dans les compartiments γ4 et γ5. À titre de comparaison, nous avons imagé les réponses des KC γd dans le compartiment γ1 proximal, qui abrite le champ présynaptique des DAN fournissant des signaux d'enseignement aversifs26,27,28. Il a déjà été démontré que la présentation des odeurs évoque une inhibition lente des KC γd19 et αβp22 des mouches naïves. Nous avons constaté que la présentation de l'odeur CS− évoquait une hyperpolarisation des KC γd dans les compartiments γ1 et γ5, quel que soit le protocole de formation (Fig. 3a – d et Extended Data Fig. 3a, b, trace violet clair). Cependant, après un entraînement multisensoriel, l'odeur CS + a produit une dépolarisation significative des axones γd KC dans le compartiment γ5 (Fig. 3a, trace violet foncé). Les réponses CS + dans le compartiment γ1 semblaient moins inhibitrices que celles de CS− (Fig. 3b; bien que les réponses soient statistiquement indiscernables), peut-être en raison de la modulation des DAN PPL1-γ1pedc par l'état de faim de la mouche29,30. L'inversion de signe multisensorielle axée sur l'entraînement de la réponse olfactive γd KC dans γ5 ne s'est pas produite après un entraînement unisensoriel uniquement olfactif (Fig. 3c, trace violet foncé) ou un entraînement non apparié (Données étendues Fig. 3a, trace violet foncé). Dans ces cas, les odeurs CS + et CS− évoquaient une hyperpolarisation dans les compartiments γ1 et γ5 (Fig. 3c, d et Extended Data Fig. 3a, b). L'imagerie des signaux évoqués par la couleur a révélé de fortes réponses aux deux couleurs dans les KC γd de mouches naïves (Extended Data Fig. 3c). L'enregistrement des KC γm a révélé un gain prononcé d'excitation restreint au compartiment γ5 par la couleur CS + après un entraînement multisensoriel, sans altération des réponses dans le compartiment γ1 (Fig. 3e, f; notez que la détection d'image à balayage laser est bloquée par un obturateur lors de la présentation des couleurs). La lumière colorée pulsée nécessaire à ces expériences d'imagerie n'a pas altéré l'apprentissage multisensoriel et la récupération visuelle (données étendues Fig. 3d, e) ou les réponses γm KC aux odeurs (données étendues Fig. 3h, i). Ces résultats indiquent que les signaux d'enseignement de récompense dopaminergiques élargissent l'excitation évoquée par l'odeur CS + et la couleur CS + au sein de l'ensemble γ-KC en recrutant les segments γ5 des axones γd KC pour qu'ils soient activés par l'odeur et activés par la couleur γm (Fig. 3g). Ces engrammes de mémoire de couleurs et d'odeurs plus grands fournissent un mécanisme permettant d'améliorer les performances de la mémoire des odeurs et des couleurs après un entraînement multisensoriel (Fig.1e, f) et expliquent pourquoi la récupération de la mémoire des odeurs dans ce contexte acquiert une exigence de sortie γd KC (Fig. 2e).

Dans les panneaux a à f, chronologies pour l'entraînement multisensoriel appétitif (couleur + odeur) ou unisensoriel appétitif (odeur) suivi d'une imagerie de réponse olfactive ou chromatique (en haut à gauche) ; plan d'imagerie dans la région γ5 ou γ1 des axones γd ou γm KC (en bas à gauche); traces d'activité olfactive CS+ et CS− (milieu) ; et la quantification des réponses (à droite) sont présentées. a, la région γ5 des axones γd KC a montré une réponse excitatrice à l'odeur CS + (une diminution de la fluorescence augmente le -ΔF / F0 du capteur de tension ASAP2f) après un entraînement multisensoriel. Les axones γ5 ont été inhibés par l'odeur CS− (diminution de −ΔF/F0). b, Aucune réponse excitatrice à l'odeur CS+ n'a été observée dans γ1 et l'odeur CS− a provoqué une inhibition. c, d, les régions γ5 (c) et γ1 (d) ont montré une inhibition des odeurs CS + et CS− après un entraînement appétitif unisensoriel (odeur). e, la région γ5 des axones γm KC a montré une réponse excitatrice uniquement à la couleur CS + après un entraînement multisensoriel. f, l'excitation à la couleur CS+ n'a pas été observée dans γ1. Pour toutes les traces et quantifications de cette étude, les données CS+ correspondent à des réponses moyennes dans lesquelles la moitié des essais ont utilisé le bleu ou le MCH comme CS+ et l'autre moitié le vert ou l'OCT comme CS+. Il en va de même pour les données CS−. Les traces d'activité évoquées par l'odeur ou la couleur montrent la moyenne (ligne pleine) avec sem (ombre). Les lignes pointillées horizontales indiquent l'activité de base. En a–d, la ligne noire continue sous les traces marque une exposition aux odeurs de 5 secondes. En e et f, la barre grise verticale correspond à la présentation de couleur de 0,75 s lorsque l'acquisition d'image est obturée et la boîte en pointillés correspond à la période de quantification de 1,75 s. Les astérisques indiquent une différence significative entre les réponses CS+ et CS− moyennes (P < 0,05). Les réponses CS+ et CS− pour chaque vol sont reliées par une ligne pointillée. Tous les groupes ont été comparés à l'aide d'un test t bilatéral apparié ; Les valeurs P exactes et les comparaisons sont fournies dans les informations supplémentaires. n = 26 mouches (a,b); n = 24 mouches (c); n = 22 mouches (d) ; et n = 16 mouches (e,f). g, modèle MB pour l'entraînement appétitif multisensoriel couleur + odeur suivi d'un test d'odeur ou de couleur unisensoriel. Les KC γm reçoivent une entrée olfactive dendritique et une entrée visuelle γd. Les deux types γ-KC projettent des axones à travers les compartiments γ1–γ5 du lobe γ MB. L'entraînement appétitif (à gauche) engage les DAN de récompense (vert) innervant γ4 et γ5, dont la dopamine libérée encode l'apprentissage en déprimant les synapses49 entre les KC activés par les odeurs et les neurones de sortie MB qui dirigent l'évitement (non illustré)14. La signalisation de la dopamine lors de l'apprentissage multisensoriel lie également l'activité γm et γd KC dans les compartiments γ4–γ5. Au cours des futurs tests d'odeurs unisensorielles (au milieu), l'odeur CS + excite des KC γm spécifiques (flèche grise épaisse), qui à leur tour activent les axones γd dans les compartiments γ4–γ5 (lignes pointillées grises à jaune). L'activation inversée à médiation γd des KC γm se produit avec un test de couleur unisensoriel (à droite).

L'imagerie en tension des somates γd KC n'a pas montré d'activation des odeurs après l'entraînement multisensoriel de la récompense (données étendues Fig. 3f, g), ce qui suggère que le recrutement axé sur l'apprentissage de ces neurones pour qu'ils soient sensibles aux odeurs ne se produit pas en améliorant l'entrée dendritique. Nous avons donc encore testé un modèle de recrutement axonal. Nous avons estimé que si les DAN dirigent le recrutement des axones γd pour qu'ils deviennent activés par les odeurs (et que les axones γm deviennent activés par la couleur), un événement d'apprentissage aversif qui nécessite la libération de dopamine par les DAN PPL1-γ1pedc qui innervent le compartiment du lobe γ1 le plus proximal31 devrait conférer une sensibilité aux odeurs sur tous les segments d'axones γd en aval de γ1 à γ5. Nous avons confirmé que l'entraînement multisensoriel aversif pour les couleurs et les odeurs (choc électrique) produisait une amélioration de la mémoire pour les signaux combinés et individuels, similaire à celle observée après un entraînement appétitif (données étendues Fig. 4a – f), et que les KC γd étaient également nécessaires pour l'amélioration de la mémoire des odeurs suite à un entraînement multisensoriel aversif (données étendues Fig. 4g – l). Nous avons ensuite utilisé l'imagerie de tension à deux photons pour tester si les axones γd à partir de γ1 ont obtenu l'activation de l'odeur CS + après un apprentissage aversif multisensoriel. La présentation de l'odeur CS− a évoqué une hyperpolarisation des KC γd dans les compartiments γ1 et γ5, quel que soit le protocole de formation (Fig. 4a, b et données étendues Fig. 4m – p, trace violet clair). En revanche, après un entraînement aversif multisensoriel, l'odeur CS + a produit une brève excitation des KC γd en γ1 et γ5 (Fig. 4a, b, trace violet foncé). Les enregistrements des réponses olfactives dans les KC γd après un apprentissage multisensoriel appétitif et aversif, et des KC γm évoqués par la couleur après un apprentissage multisensoriel appétitif, sont donc cohérents avec la localisation des signaux d'enseignement DAN déterminant la partie d'un axone γ-KC qui gagne l'activation par l'autre modalité CS +. Alors que l'apprentissage aversif rend tous les segments axonaux en aval de γ1 excitables par la modalité réciproque (Fig. 4c), l'apprentissage par récompense modifie principalement l'excitation CS + dans les segments γ4 et γ5 (Fig. 3g).

a,b, Cours d'entraînement multisensoriel aversif (couleur + odeur) et d'imagerie des odeurs (en haut à gauche). Le plan d'imagerie dans la région γ1 (a) ou γ5 (b) des axones γd KC (en bas à gauche). Traces d'activité olfactive CS+ et CS− (milieu). Quantification des réponses évoquées par les odeurs (à droite). La région γ1 a montré une excitation à l'odeur CS+ et une inhibition à l'odeur CS− après un entraînement multisensoriel aversif (a). L'odeur CS+ a suscité moins d'inhibition en γ1 que CS− (b). Les traces d'activité évoquées par l'odeur montrent la moyenne (ligne pleine) avec sem (ombre). Les lignes pointillées horizontales indiquent l'activité de base. La ligne noire continue sous les traces marque une exposition aux odeurs de 5 s. Les astérisques indiquent une différence significative entre les réponses CS+ et CS− moyennes (P < 0,05). Les réponses CS+ et CS− pour chaque vol sont reliées par une ligne pointillée. c, modèle MB pour un entraînement multisensoriel aversif suivi d'un test d'odeur. L'entraînement multisensoriel aversif (à gauche) engage les DAN punitifs (rouges) qui dépriment les synapses16,17 entre les KC γm et γd et les neurones de sortie γ1 et γ2 MB qui dirigent l'approche16,17 (non illustrés) tout en liant également l'activité γd et γm KC dans ces compartiments. Le test d'odeur unisensorielle (à droite) excite des KC γm spécifiques, qui activent les axones γd à partir de γ1 vers l'avant. d,e, L'apprentissage multisensoriel aversif antérieur améliore l'apprentissage futur des odeurs appétitives mais non aversives. Les protocoles sont affichés (à gauche). Les mouches affamées ont été divisées en entraînement multisensoriel aversif (groupe I) et en entraînement olfactif unisensoriel aversif (groupe II). Trois heures plus tard, les deux groupes ont été entraînés avec des odeurs et une récompense sucrée (en utilisant les mêmes odeurs CS+ ou CS− que pour l'entraînement initial) et testés immédiatement après. Les performances de la mémoire sont également affichées (à droite). Le groupe I initialement formé avec le protocole aversif multisensoriel a obtenu de meilleurs résultats que le groupe II initialement formé avec uniquement les odeurs (d). Le groupe I initialement formé avec le protocole appétitif multisensoriel n'a pas surpassé le groupe II initialement formé avec uniquement les odeurs (e). Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. Les groupes ont été comparés à l'aide d'un test t bilatéral apparié (a, b) et d'un test t bilatéral non apparié (d, e); Les valeurs P exactes et les comparaisons sont fournies dans les informations supplémentaires. n = 24 mouches (a,b), n = 12 (d) et n = 8 (e).

On pourrait s'attendre à ce qu'une expansion de la représentation de l'odeur CS + dans un segment particulier des axones γd après un entraînement multisensoriel facilite l'apprentissage ultérieur avec la même odeur, si le signal d'enseignement DAN suivant croise la représentation KC élargie. Nous avons testé cette notion en entraînant séquentiellement des mouches avec un protocole multisensoriel aversif (dopamine dans γ1) ou appétitif (dopamine dans γ4 et γ5) suivi d'un apprentissage unisensoriel de récompense d'odeur ou de punition d'odeur (Fig 4f, g). L'entraînement aversif multisensoriel antérieur a considérablement amélioré l'apprentissage ultérieur de la récompense des odeurs (Fig. 4d). Cependant, aucune amélioration n'était apparente si l'apprentissage olfactif aversif suivait l'apprentissage appétitif multisensoriel (Fig. 4e). Par conséquent, l'expansion multisensorielle dépendante de l'entraînement de la représentation de l'odeur CS + peut être incluse dans le prochain engramme de mémoire d'odeur CS + si les segments d'axone γd appropriés sont devenus activés par l'odeur CS +.

L'anatomie du réseau MB suggère deux façons possibles de conférer une réactivité aux odeurs aux axones γd KC : via des synapses KC – KC ou des neurones positionnés pour relier les différents flux KC. Nous avons interrogé la faisabilité anatomique de ces voies en utilisant le connectome MB complet d'un seul volume de microscope électronique «hémi-cerveau» de mouche adulte32,33. Bien que la plupart (562 sur 590) des KC γm fassent des synapses avec des KC γd, le nombre et l'emplacement de ces connexions ne permettent pas à chaque KC γd de recevoir une entrée γm dans chaque compartiment du lobe γ. De plus, il a été rapporté que les connexions KC-KC supprimaient l'activité dans les KC voisins34. Nous avons ensuite étudié l'anatomie fine de l'innervation du lobe γ du neurone médian apparié dorsal sérotoninergique (DPM) potentiellement excitateur dans le volume du microscope électronique de l'hémicerveau. Les neurones DPM envoient des branches séparées qui innervent de manière dense les lobes verticaux et horizontaux et le pédoncule distal du MB, où ils sont à la fois présynaptiques et post-synaptiques aux KC35,36,37. L'ultrastructure des projections neuronales DPM dans le lobe γ a révélé deux branches dans γ1 et d'autres branches ventrales et dorsales traversant les compartiments γ2 – γ5 (Fig. 5a). Les positions des synapses neuronales DPM sur les γd KC suivent le faisceau d'axones γd KC lorsqu'il s'enroule autour du lobe γ de ventral dans le compartiment γ1 à dorsal dans le compartiment γ5 (Fig. 5a).

a, représentation 3D de MB (gris clair) avec les neurites du lobe γ du neurone DPM (bleu sarcelle) (à gauche). DPM trifurque (astérisque) en branches dorsale (sarcelle foncée), ventrale (sarcelle claire) et compartiment γ1 (sarcelle). Les neurites sont ombrées par l'ordre de Strahler et les brindilles avec un ordre de Strahler inférieur à 1 ont été taillées. Les détails du lobe γ avec les bordures des compartiments γ1–γ5 (lignes pointillées) sont affichés (à droite). Les présynapses du DPM aux KC γd (sphères jaunes) colocalisent sur la branche dorsale du DPM en γ5. Les synapses d'entrée des γm KC (sphères grises) à DPM sont situées dans les branches ventrales et dorsales. Dans γ5, 450 KC sur 585 γm ont fait des synapses avec la branche dorsale du DPM, où 89 des 98 KC γd ont également reçu une entrée DPM. Les entrées neuronales APL (sphères magenta) se localisent le long des deux branches DPM. b, projection de dendrogramme 2D des neurites DPM (nuances de sarcelle; voir Données étendues Fig. 5a pour plus de détails). Le compartiment γ1 est marqué et les compartiments γ2–γ5 sont divisés entre les branches neuronales DPM dorsale et ventrale. Les entrées des γm KC (sphères grises) et les sorties des γd KC (sphères jaunes) colocalisent sur des branches spécifiques au compartiment. Les entrées inhibitrices du neurone APL (sphères magenta) sont réparties sur les neurites DPM. La connectivité APL est détaillée dans Données étendues Fig. 5b. c,d, schéma neuronal DPM (c; haut). La chronologie avec le changement de température (ligne pointillée) est également affichée. Le blocage de la sortie des neurones DPM avec VT64246-GAL4;UAS-Shits1 pendant l'entraînement (c) ou le test (d) de la performance de récupération olfactive de 6 h est affiché (en bas). e, f, Chronologies d'entraînement multisensoriel appétitif (couleur + odeur) et d'imagerie des odeurs pour les neurones DPM (à gauche). Les plans d'imagerie dans les régions γ5 (e) et γ1 (f) des neurones DPM et les traces d'activité évoquée par les odeurs CS + et CS- sont affichés (au milieu). La quantification des réponses est affichée (à droite). Les régions γ5 et γ1 de DPM ont montré des réponses excitatrices aux odeurs CS+ et CS−, mais les réponses CS+ n'étaient spécifiquement améliorées que dans γ5. g, Chronologie (à gauche). Inactivation ARNi des récepteurs 5-HT2A, mais pas 5-HT2B ou 5-HT7, dans les KC γd avec MB607B-GAL4 altéré les performances de récupération olfactive après un entraînement multisensoriel. Dans c, d, g, les données sont représentées sous forme de moyenne ± sem, les points de données individuels sont affichés sous forme de points et les astérisques indiquent une différence significative (P < 0,05). Bkg, arrière-plan ARNi. h, Chronologie de l'entraînement multisensoriel appétitif et de l'imagerie des odeurs (en haut à gauche). Le plan d'imagerie en γ5 des axones γd KC (en bas à gauche). Traces d'activité olfactive CS+ et CS− (milieu). Le 5HT2AR-ARNi a éliminé l'excitation évoquée par le gain d'odeur dans γ5 des KC γd après un entraînement multisensoriel (voir également Fig. 3a); Les odeurs CS+ et CS− inhibent de manière similaire les axones γd KC. La quantification est également indiquée (à droite). Les traces d'activité évoquées par l'odeur montrent la moyenne (ligne pleine) avec sem (ombre). Les lignes pointillées horizontales indiquent l'activité de base. La ligne noire continue sous les traces marque une exposition aux odeurs de 5 secondes. L'astérisque dans e indique une différence significative entre les réponses CS+ et CS− moyennes (P < 0,05). Les réponses CS+ et CS− pour chaque vol sont reliées par des lignes pointillées. Les groupes ont été comparés à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (c, d), d'un test t bilatéral apparié (e, f, h) et d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Dunnett (g) ; Les valeurs P exactes et les comparaisons sont fournies dans les informations supplémentaires. n = 8 pour Shi et n = 9 pour les autres groupes (c) ; n = 10 (d,g); n = 26 mouches (e,f); et n = 24 mouches (h). Voir Données étendues Fig. 7 pour les contrôles. i, modèle de microcircuit DPM reliant les KC spécifiques à l'odeur et à la couleur suite à un apprentissage multisensoriel.

L'annotation d'un dendrogramme de neurites DPM (Fig. 5b) avec des limites de compartiment γ-lobe (basées sur la connectivité DAN), des synapses de γm KC et celles des γd KC, a montré que des branches uniques du neurone DPM peuvent fournir des ponts de microcircuit spécifiques au compartiment entre γm et γd KC. Les neurones DPM peuvent également relier les KC γd aux γm (Extended Data Fig. 5a). Il a été constaté que le grand neurone GABAergique antérieur latéral apparié (APL) 38 faisait des synapses le long des branches DPM dans le lobe γ (Fig. 5b et Extended Data Fig. 5a), ce qui suggère que le pontage DPM peut être régulé par une inhibition locale. Le neurone APL reçoit de nombreuses entrées DAN dans chaque compartiment et peut donc également être régulé avec une spécificité de région39 (Extended Data Fig. 5b), pour potentiellement libérer des branches DPM spécifiques de l'inhibition de l'APL.

Nous avons contesté ce modèle putatif de pont de microcircuit en manipulant indépendamment les neurones APL et DPM. L'expression dans les neurones APL du récepteur de la dopamine DopR2 a été liée à l'apprentissage aversif40, et le profilage transcriptionnel a suggéré que les neurones APL expriment également le récepteur DopEcR41. Ces deux récepteurs de la dopamine sont connus pour avoir une action inhibitrice42,43. Nous avons donc utilisé tubP-GAL80ts (réf. 44) pour restreindre temporellement l'ARNi transgénique dans les neurones APL afin de tester un rôle de ces récepteurs dans l'apprentissage multisensoriel. La suppression de Dop2R dans les neurones APL adultes a supprimé l'amélioration multisensorielle des performances de récupération olfactive (données étendues Fig. 6a, c). Un léger défaut a également été observé pour la mémoire des odeurs suite au conditionnement olfactif appétitif ; cependant, la différence n'était significative que pour un contrôle (données étendues Fig. 6b, d). En revanche, l'ARNi DopEcR n'a eu aucun effet dans aucune des deux expériences (données étendues Fig. 6e, f). Ces résultats sont cohérents avec le renforcement des neurones APL inhibiteurs de la dopamine pour permettre le recrutement de γd KC dans l'engramme de la mémoire olfactive lors de l'apprentissage multisensoriel.

Nous avons testé un rôle pour les neurones DPM sérotoninergiques en utilisant l'expression de UAS-Shits1. La restriction temporelle de la transmission à partir des neurones DPM lors de l'acquisition (Fig. 5c et Extended Data Fig. 7a) ou de la récupération (Fig. 5d et Extended Data Fig. 7a) a considérablement altéré l'amélioration de l'entraînement multisensoriel de la mémoire de récupération des odeurs. Le blocage de la sortie neuronale du DPM a également altéré la récupération de la mémoire visuelle après un apprentissage multisensoriel (Extended Data Fig. 7b). Ces mêmes manipulations n'ont eu aucun effet sur la mémoire des odeurs après un apprentissage olfactif unisensoriel (Extended Data Fig. 7c), comme dans une étude précédente45. Ces données sont cohérentes avec la sortie neuronale DPM requise lors de l'apprentissage pour lier simultanément des flux KC actifs, tandis que la sortie neuronale DPM lors de la récupération de la mémoire fournit la connexion pour que les KC γm commandés par les odeurs activent les KC γd pertinents.

Nous avons ensuite effectué des expériences comportementales et physiologiques pour tester directement un modèle selon lequel l'apprentissage multisensoriel établit un pont de microcircuit neuronal DPM excitateur entre les KC olfactifs γm et visuels γd. Nous avons d'abord utilisé UAS-Shits1 pour déterminer si la sortie γ-KC (γm et γd) était nécessaire pendant l'entraînement pour améliorer la récupération de la mémoire olfactive et visuelle après un entraînement multisensoriel. Alors que le blocage des γ-KC au cours de l'apprentissage multisensoriel a considérablement altéré la récupération olfactive et visuelle (Extended Data Fig. 7e – h), il n'a pas altéré l'apprentissage olfactif (Extended Data Fig. 7d), comme dans les études précédentes46,47,48. Constater que la plasticité du réseau de la mémoire multisensorielle nécessite une sortie KC suggère qu'elle implique des règles d'apprentissage différentes de celles de la mémoire olfactive unisensorielle16,49.

Nous avons utilisé UAS-ASAP2f pour rechercher la plasticité spécifique au compartiment de la connectivité fonctionnelle des neurones DPM après l'apprentissage multisensoriel de la récompense. Il a été démontré que l'apprentissage de la récompense olfactive augmentait spécifiquement les réponses calciques des neurones DPM à l'odeur CS + jusqu'à 2, 5 h (réf. 36, 50) (voir les enregistrements de tension d'une heure; Données étendues Fig. 7k – l). L'enregistrement 6 h après l'entraînement multisensoriel a révélé une augmentation claire et spécifique des réponses de tension d'odeur CS + dans les projections DPM dans le compartiment γ5, mais pas le compartiment γ1 (Fig. 5e, f), qui était absent à ce moment après l'apprentissage olfactif (Extended Data Fig. 7i, j). Cela suggère que l'apprentissage de la récompense multisensorielle potentialise les synapses des KC γm spécifiques à l'odeur CS + vers les neurones DPM dans le microcircuit du compartiment γ5 du MB. Comme notre imagerie précédente des KC γd a montré qu'ils deviennent également activés par l'odeur CS + dans leurs segments γ5 après l'apprentissage de la récompense multisensorielle (Fig. 3a), nous avons testé si la réactivité du gain de l'odeur γd pouvait être médiée par la sérotonine libérée par les neurones DPM (5-hydroxytryptamine (5-HT)). Nous avons d'abord établi que l'application de bain de 5-HT (en présence de tétrodoxine pour bloquer l'activation indirecte via d'autres neurones) évoquait directement la dépolarisation des KC γd exprimant UAS-ASAP2f chez les mouches naïves (Extended Data Fig. 7o, p). La 5-HT peut exercer des effets excitateurs via les récepteurs de type 5-HT2A et 5-HT751. Nous avons donc utilisé l'ARNi pour renverser ces récepteurs dans les KC γd. La réduction de l'expression des récepteurs 5-HT2A, mais pas 5-HT7 ou 5-HT2B, a altéré les performances de la mémoire olfactive après un entraînement multisensoriel (Fig. 5g) mais pas un entraînement olfactif (Extended Data Fig. 7q). De plus, la co-expression de l'ARNi 5-HT2A avec UAS-ASAP2f dans les KC γd a supprimé l'activation de l'odeur induite par l'apprentissage multisensoriel du gain de CS + dans la région γ5 des KC γd (Fig. 5h), mais n'a pas affecté les réponses évoquées par la couleur (Extended Data Fig. 7r). Ensemble, ces données anatomiques, génétiques et physiologiques nous amènent à conclure que la dopamine spécifique au compartiment évoquée par le renforçateur libère une inhibition médiée par l'APL, ce qui facilite la même dopamine renforçante pour induire la plasticité KC – DPM et DPM – KC qui forme une odeur sérotoninergique excitatrice. – ponts de microcircuit DPM spécifiques à la couleur entre les KC γm et γd pertinents (Fig. 5i), et probablement vice versa.

Notre étude décrit un mécanisme neuronal précis chez la drosophile par lequel l'apprentissage multisensoriel améliore les performances de la mémoire ultérieure, même pour les signaux sensoriels individuels. Un seul essai d'entraînement avec des repères visuels ne pourrait générer des performances de mémoire robustes que s'ils étaient combinés avec des odeurs pendant l'entraînement, similaire à l'apprentissage de la perception du rythme visuel chez l'homme, qui nécessite des informations auditives d'accompagnement52. Nous avons montré que l'apprentissage multisensoriel lie les informations des odeurs et des couleurs temporellement contingentes dans les axones des MB γ-KC, via les neurones DPM sérotoninergiques, dont l'activité définit également la fenêtre temporelle de coïncidence53. Cette liaison axée sur l'apprentissage convertit les axones de KC sélectifs visuellement (vraisemblablement de couleur) pour qu'ils deviennent également sensibles à l'odeur entraînée temporellement contingente. Nous avons également démontré que les axones des KC olfactifs sélectifs sont activés par la couleur entraînée temporellement contingente. Bien que l'entrée dendritique prédominante définisse les KC γm comme étant olfactives et γd comme étant visuelles, nos enregistrements ont montré que des segments de leurs axones deviennent multimodaux après un apprentissage multisensoriel. Ce résultat suggère que les γ-KC sont un substrat probable où d'autres informations sensorielles temporellement contingentes peuvent être intégrées à celles des signaux sensoriels explicites54,55.

Bien que nos expériences se soient principalement concentrées sur les KC γm activés par les odeurs recrutant des KC γd de couleur via des microcircuits DPM, l'amélioration comportementale observée de la mémoire visuelle suite à un apprentissage multisensoriel, la démonstration que les KC γm deviennent sensibles à la couleur entraînée et la connectivité réciproque des neurones DPM suggèrent que les neurones DPM interviennent probablement aussi dans un pont de polarité inverse. Ce faisant, l'apprentissage multisensoriel utilise les neurones DPM pour relier les KC qui répondent à chaque signal sensoriel contingent dans le temps et étend les représentations de chaque signal à celles de l'autre. Cette expansion intermodale permet à l'expérience multisensorielle d'être efficacement récupérée par des signaux combinés et par chacun individuellement. En conséquence, les mouches entraînées peuvent évoquer le souvenir d'une expérience visuelle avec l'odeur apprise et le souvenir d'une odeur avec la couleur apprise. Ces découvertes fournissent un mécanisme neuronal par lequel la mouche atteint un équivalent conceptuel de l'achèvement du modèle dépendant de l'hippocampe chez les mammifères, dans lequel des scènes partielles peuvent récupérer une représentation de mémoire plus complète56. Les patients humains atteints de schizophrénie et d'autisme présentent des déficits d'intégration multisensorielle57, et ces conditions ont été liées à un dysfonctionnement sérotoninergique et aux récepteurs 5-HT2A58. Notre travail ici suggère qu'un routage inapproprié des perceptions multisensorielles peut contribuer à ces conditions. De plus, les récepteurs excitateurs 5-HT2A qui interviennent dans la liaison multisensorielle sont les principales cibles des drogues hallucinogènes59.

Toutes les souches de Drosophila melanogaster ont été élevées à 25 °C et 40 à 50 % d'humidité, sauf indication contraire, sur un aliment standard à base de semoule de maïs (100 g l−1 de d-glucose anhydre, 47,27 g l−1 de farine de maïs biologique, 25 g l−1 de levure autolysée, 7,18 g l−1 d'agar et 12,18 g de Tegosept dissous dans 8,36 ml d'éthanol absolu , par litre de nourriture pour mouches) dans un cycle lumière/obscurité de 12 h 12. Les mouches Canton-S ont été utilisées comme type sauvage (WT) et provenaient du laboratoire de William Quinn (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA). Les lignées GAL4 suivantes ont été utilisées dans les expériences comportementales : MB607B-GAL4 (réf. 13, 60), MB009B-GAL4 (réf. 13, 60), c708a-GAL4 (réf. 61), VT43924-GAL4.2 (réf. 39) et VT64246-GAL4 (réf. 62). Le blocage de la sortie neuronale sous contrôle de la température a été obtenu en exprimant le transgène UAS-Shits1 (réf. 21) sous le contrôle des pilotes MB607B-GAL4 (réf. 13, 60), MB009B-GAL4 (réf. 13, 60), c708a-GAL4 (réf. 61) et VT64246-GAL4 (réf. 62). Pour les expériences d'inactivation d'ARNi impliquant l'APL, des mouches tubP-GAL80ts (réf. 44), VT43924-GAL4.2 (réf. 39) ont été croisées avec des mouches UAS-Dop2R RNAi63 et UAS-DopEcR RNAi (VDRC ID : 103494). La même lignée pilote a été croisée avec des mouches WT et la souche de fond ARNi (ID VDRC : 60100), en tant que témoins. Pour les expériences de knockdown ARNi impliquant des KC γd, des mouches MB607B-GAL4 (réf. 13,60) ont été croisées avec des mouches UAS-5-HT2A RNAi (31882, BDSC), UAS-5-HT2B RNAi (60488, BDSC) et UAS-5-HT7 RNAi (27273, BDSC). La même lignée pilote a été croisée avec la souche de fond ARNi (36304, BDSC), en tant que témoins. Pour les expériences d'imagerie en direct, UAS-ASAP2f64 a été exprimé en utilisant MB607B-GAL4 (réf. 13, 60) et VT64246-GAL4 (réf. 62) et UAS-ASAP2s65 avec la ligne de pilote 1471-GAL4 (réf. 66). Nous avons utilisé des mouches mâles et femelles pour les expériences comportementales et d'imagerie.

Les mouches mâles des lignées GAL4 ont été croisées avec des femelles vierges UAS-Shits1, à l'exception des expériences impliquant c708a-GAL4, dans lesquelles des mâles UAS-Shits1 ont été croisés avec des femelles vierges c708a-GAL4. Pour les témoins hétérozygotes, les mouches GAL4 ou UAS-Shits1 ont été croisées avec les mouches WT. Dans les expériences ARNi, les mouches GAL4 ou ARNi ont été croisées avec les souches de fond ARNi appropriées ou les mouches WT, respectivement. Toutes les mouches ont été élevées à 25 ° C, sauf indication contraire ci-dessous pour la manipulation de l'expression de l'ARNi. Des populations de mouches âgées de 2 à 8 jours ont été utilisées dans toutes les expériences.

Pour les expériences de conditionnement appétitif, 80 à 100 mouches ont été placées dans un flacon de 25 ml contenant 1% de gélose (comme source d'eau) et un morceau de papier filtre de 20 × 60 mm pendant 19 à 22 h avant l'entraînement et ont été maintenus affamés pendant toute l'expérience, sauf lors du dosage de la mémoire de 24 h dans laquelle les mouches ont été nourries pendant 30 min après l'entraînement, puis remises dans des flacons de famine jusqu'au test. Pour les expériences de conditionnement aversif, 80 à 100 mouches ont été placées dans un flacon contenant de la nourriture standard et un morceau de papier filtre pendant 14 à 22 h avant les expériences comportementales.

Pour les expériences impliquant un blocage neuronal avec UAS-Shits1, un schéma de la chronologie du changement de température est fourni dans chaque figure. Pour les expériences Shits1, les mouches ont été transférées à une température restrictive de 33 ° C pendant 30 min avant l'entraînement et/ou les tests. Pour les expériences d'ARNi impliquant tubP-GAL80ts;VT43924-GAL4.2, les mouches ont été élevées à 18 ° C et déplacées à 29 ° C après éclosion pour induire l'expression d'ARNi pendant 3 jours avant les expériences comportementales. Les mouches sont restées à 29 °C pendant toute la durée des expériences.

Toutes les expériences comportementales ont été menées à l'aide d'un labyrinthe en T standard qui a été modifié pour permettre la livraison simultanée de stimuli de couleur et d'odeur. Le labyrinthe en T, fabriqué à partir de plastique translucide, était recouvert d'un film occultant opaque pour minimiser les interférences entre les stimuli visuels lorsqu'ils étaient utilisés en parallèle. Les odeurs étaient MCH et OCT diluées dans de l'huile minérale (à une dilution d'environ 1:10-3). Les couleurs étaient fournies par des diodes électroluminescentes (LED); LED vertes avec une longueur d'onde de 530 ± 10 nm (PM2E-3LGE-SD, ProLight Opto) et LED bleues avec une longueur d'onde de 465 ± 10 nm (PM2B-3LDE-SD, ProLight Opto). Quatre LED ont été assemblées dans un circuit construit sur un dissipateur de chaleur et ont été montées solidement au-dessus des tubes de distribution d'odeurs. Les intensités des LED ont été ajustées de manière à ce que les mouches naïves ne montrent aucune préférence phototactique entre les bras éclairés du labyrinthe en T. Les stimuli visuels ont été présentés de la même manière et avec la même intensité pour l'entraînement et les tests. Pour les expériences appétitives, les tubes à essai étaient tapissés de papier filtre; pour les expériences aversives, les tubes à essai étaient garnis de grilles de choc non électrifiées. Les expériences ont été réalisées dans une chambre climatique réglée à la température souhaitée et à une humidité relative de 55 à 65 %. Les mouches ont été manipulées avant l'entraînement et les tests sous un feu rouge aérien.

Le conditionnement appétitif a été effectué essentiellement comme décrit précédemment67. En bref, les mouches ont été exposées pendant 2 min à des stimuli Y (YColour et/ou YOdour) sans renfort dans un tube avec du papier filtre sec (CS−), 30 s d'air pur, puis 2 min avec des stimuli X (XColour et/ou XOdour) présentés avec 5,8 M de saccharose séché sur papier filtre (CS+). Pour le conditionnement olfactif aversif17,18, les mouches ont reçu une exposition de 1 min aux stimuli X (XColour et/ou XOdour) couplée à douze décharges électriques de 90 V à intervalles de 5 s (CS+), 45 s d'air pur, suivies d'une exposition de 1 min aux stimuli Y (YColour et/ou YOdour) sans renforcement (CS−). Les chocs électriques ont été administrés à l'aide d'un stimulateur d'impulsions carrées Grass S48 (Grass Technology). Les grilles de choc sont celles décrites précédemment68 et consistent en des rangées de cuivre entrelacées imprimées sur un film de Mylar transparent, qui laisse passer la lumière colorée.

Les performances de la mémoire ont été évaluées en testant les mouches pour leur préférence entre les couleurs et/ou les odeurs CS− et CS+ pendant 2 min. Les tests d'odeur ont été effectués dans l'obscurité. Les mouches de chaque bras ont été collectées et transférées dans des tubes en polystyrène (tube à essai en polypropylène à fond rond de 14 ml avec bouchon, Falcon). Les tubes avec des mouches ont été congelés à -20 ° C et les mouches ont ensuite été retirées et comptées manuellement.

Les indices de performance ont été calculés comme le nombre de mouches dans le bras CS+ moins le nombre dans le bras CS−, divisé par le nombre total de mouches. Pour toutes les expériences comportementales, un seul échantillon, ou n, représente l'indice de performance moyen de deux groupes indépendants de mouches entraînées avec les combinaisons réciproques couleur-odeur comme CS+ et CS−. Le n total pour chaque expérience a été acquis au cours de trois séances d'entraînement différentes à des jours différents.

Six protocoles comportementaux ont été utilisés :

Apprentissage visuel : les couleurs (XColour et YColour) ont été utilisées comme CS+ et CS−.

Apprentissage olfactif : les odeurs (XOdour et YOdour) ont été utilisées comme CS+ et CS−.

Protocole congruent : couleurs et odeurs ont été combinées (XColour + XOdour et YColour + YOdour) en CS+ et CS−. Les mêmes combinaisons de couleurs et d'odeurs ont été utilisées pendant la formation et les tests.

Protocole incongru : les contingences de stimulus de couleur et d'odeur ont été inversées entre l'entraînement (XColour + YOdour et YColour + XOdour) et le test (XColour + XOdour et YColour + YOdour).

Les protocoles d'apprentissage visuel et olfactif sont unisensoriels, alors que les protocoles congruents et incongruents sont multisensoriels.

Récupération olfactive : les mouches ont été entraînées comme dans le protocole congruent, mais seules les odeurs (XOdour et YOdour) ont été présentées comme choix lors du test.

Récupération visuelle : les mouches ont été entraînées comme dans le protocole congruent, mais seules les couleurs (XColour et YColour) ont été présentées comme choix lors du test.

Les expériences d'apprentissage séquentiel décrites sur les figures 4f, g ont utilisé un entraînement multisensoriel congruent aversif ou appétitif suivi d'un apprentissage olfactif appétitif ou aversif unisensoriel, puis de tests utilisant la récupération olfactive.

Toutes les mouches ont été élevées à 25 ° C et des mouches mâles et femelles âgées de 3 à 8 jours ont été utilisées dans toutes les expériences. Les expériences d'imagerie ont été réalisées essentiellement comme décrit précédemment69,70,71. En bref, les mouches ont été formées dans la configuration du labyrinthe en T en utilisant soit l'apprentissage olfactif (protocole 2), un protocole multisensoriel congruent (protocole 3) ou un protocole de formation non apparié. Lors d'un entraînement non apparié, les mouches ont été exposées à l'odeur et aux stimuli visuels combinés (combinaison XColour + XOdour et YColour + YOdour), mais le choc ou le sucre a été présenté seul 2 min avant ou après le CS+, respectivement. Après l'entraînement, les mouches ont été maintenues dans l'obscurité jusqu'à l'enregistrement. Juste avant l'enregistrement, les mouches ont été brièvement immobilisées sur de la glace et montées dans une chambre sur mesure permettant le libre mouvement des antennes et des pattes. La capsule céphalique a été ouverte sous une solution tampon carbogène à température ambiante (95 % d'O2 et 5 % de CO2) et la mouche, dans la chambre d'enregistrement, a été placée sous un microscope à deux photons (Scientifica). Pour les mouches affamées, le tampon sans sucre suivant a été utilisé : 108 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM HEPES, 15 mM ribose, 4 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2 et 8,2 mM MgCl2, osmolarité 272 mOsm, pH 7,3). Pour les mouches nourries, le tampon suivant a été utilisé : NaCl 103 mM, KCl 3 mM, N-Tris 5 mM, tréhalose 10 mM, glucose 10 mM, saccharose 7 mM, NaHCO3 26 mM, NaH2PO4 1 mM, CaCl2 1,5 mM et MgCl2 4 mM, osmolarité 275 mOsm, pH 7,3).

Les mouches ont été soumises à un courant d'air constant, transportant de la vapeur provenant d'un solvant d'huile minérale (air). Pour les expériences d'imagerie évoquées par les odeurs, les mouches ont été exposées séquentiellement à l'odeur CS + et CS−, chacune pendant 5 s, entrecoupées de 30 s, pour simuler le test comportemental. Comme dans les expériences de comportement, les odeurs étaient MCH et OCT (diluées dans de l'huile minérale à environ 1:10−3), et elles étaient utilisées réciproquement comme CS+ et CS−. Toutes les mouches qui n'ont pas répondu à l'une des deux odeurs présentées ont été exclues des analyses ultérieures. Pour les expériences d'imagerie évoquées par la couleur, la présentation des couleurs a été entrelacée avec l'acquisition d'images. Ceci a été réalisé en utilisant un obturateur sur l'objectif (obturateur de faisceau optique à diaphragme en acier inoxydable Ø1/2" avec contrôleur, Thorlabs) et un deuxième obturateur à commande externe (obturateur Uni-Stable Vincent/UniBlitz VS35S2ZM1R1-21 ; pilote d'obturateur/contrôleur de minuterie UniBlitz VMM-T1) sur le système de livraison à LED. Pour chaque cycle d'enregistrement, la couleur a été présentée pendant 0,75 s à 0,4 Hz et suivie d'une acquisition s. Il est important de noter que la présentation des couleurs pulsées à 0, 4 Hz a évoqué des réponses robustes dans les KC γd chez les mouches naïves, mesurées avec UAS-ASAP2f (données étendues Fig. 4h), et les tests de mémoire comportementale avec des couleurs scintillantes à 0, 4 Hz ont produit des performances de mémoire similaires à celles générées avec la présentation couleur continue (données étendues Fig. 4d, e). AP2f, que nous avons considéré comme bénéfique pour l'acquisition d'images, étant entrelacé avec la présentation des couleurs Les mouches ont été exposées séquentiellement quatre fois à la couleur CS + puis quatre fois à la couleur CS− avec chaque présentation de couleur suivie d'un cycle d'acquisition d'image. Un intervalle de 30 secondes sépare les enregistrements CS+ et CS−. Le bleu et le vert ont été utilisés réciproquement comme CS+ et CS−. Un hémisphère du cerveau a été choisi au hasard pour imager les axones KC. Il est rarement possible d'imager tous les compartiments MB du lobe γ car γ1 et γ5 sont le plus souvent dans des plans différents. Nous avons donc dû analyser ces deux compartiments indépendamment.

La fluorescence a été excitée en utilisant des impulsions d'environ 140 fs, une fréquence de répétition de 80 MHz, centrées sur 910 nm générées par un laser Ti-Sapphire (Chameleon Ultra II, Coherent). Des images de 256 × 256 pixels ont été acquises à 5,92 Hz, contrôlées par le logiciel ScanImage 3.872. Les odeurs ont été délivrées à l'aide d'un système conçu sur mesure73, contrôlé par LabView (v.11).

Pour l'application aiguë de 5-HT, nous avons utilisé un système de pompe à perfusion (14-284-201, Fisher Scientific) pour délivrer en continu une solution saline à un débit d'environ 0,043 ml s-1. La 5-HT a été appliquée en présence de tétrodotoxine 1 µM pour bloquer les canaux sodiques voltage-dépendants et la propagation des potentiels d'action qui pourraient entraîner une excitation indirecte. Pour examiner les effets de la sérotonine sur la tension membranaire γd KC, la fluorescence de base a été enregistrée pendant 5 min avant de passer à une solution contenant 100 μM de chlorhydrate de sérotonine (H9523, Sigma Aldrich) pendant 5 min supplémentaires d'enregistrement. Le lavage a été effectué en retransformant la solution en solution saline. Le temps d'application et la concentration de 5-HT utilisés sont comparables aux études physiologiques récentes appliquant de la 5-HT exogène au cerveau de la drosophile74,75,76,77. En raison de la longueur du tube de perfusion et du volume mort, le commutateur de perfusion a mis environ 70 s pour atteindre le cerveau.

Pour l'analyse, les images de fluorescence à deux photons ont été segmentées manuellement à l'aide de Fiji78, à l'aide d'un code personnalisé comprenant un plugin de stabilisation d'image79. Le mouvement des animaux était suffisamment petit pour que les images ne nécessitent pas d'enregistrement. Pour les analyses quantitatives ultérieures, des scripts personnalisés Fiji et MATLAB ont été utilisés. La fluorescence de base, F0, a été définie pour chaque réponse de stimulus comme la fluorescence moyenne F de 2 s avant et jusqu'au point de présentation de l'odeur ou de la couleur (ou 30 s après le début des enregistrements pour les traitements 5-HT). -ΔF/F0 décrit donc la fluorescence par rapport à cette ligne de base. Pour les réponses évoquées par les odeurs des KC, l'aire sous la courbe a été mesurée comme l'intégrale de -ΔF/F0 pendant la stimulation olfactive de 5 s. Nous avons choisi de conserver les unités naturelles de l'expérience lors du rapport de l'aire intégrée sous la courbe (c'est-à-dire (−ΔF/F0) × (5 s)), car nous ne faisons aucune inférence concernant la forme de la réponse. Pour les réponses KC évoquées par la couleur, le signal de fluorescence moyen (-ΔF/F0) pour le premier cycle d'acquisition (1,75 s) a été quantifié. Chaque n correspond à un enregistrement d'une mouche individuelle différente. Toutes les données ont été acquises au cours de trois séances d'entraînement différentes à des jours différents.

Pour les traitements 5-HT, nous avons défini le "pré-traitement" comme la valeur moyenne -ΔF/F0 pendant 300 s avant l'administration de 5-HT, l'application 5-HT était la moyenne -ΔF/F0 pendant 300 s pendant l'administration de 5-HT et le traitement de "lavage" comme la moyenne -ΔF/F0 pendant 300 s à partir du décalage de l'administration du médicament. Les traces ont été lissées sur 5 s par un filtre à moyenne mobile. Chaque n correspond à un enregistrement d'une mouche individuelle différente. Toutes les données ont été acquises au cours de trois sessions d'imagerie différentes à des jours différents.

Les données ASAP2f et ASAP2s sont présentées sous la forme -ΔF/F0 pour corriger la relation inverse entre la fluorescence du capteur et la tension de la membrane.

Les analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism. Toutes les données comportementales ont été analysées avec un test t bilatéral non apparié, un test U de Mann – Whitney, une ANOVA unidirectionnelle ou un test H de Kruskal – Wallis suivi d'un test de comparaisons multiples post-hoc de Tukey, Dunnett ou Dunn. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. La taille des échantillons était similaire à celle d'autres publications dans le domaine. Pour les expériences d'imagerie, les réponses évoquées par les odeurs ont été comparées par un test t bilatéral apparié pour les données normalement distribuées et des mesures répétées ANOVA unidirectionnelle, et le test de rang signé de Wilcoxon a été utilisé pour les données distribuées non gaussiennes. La normalité a été testée à l'aide du test de normalité de D'Agostino et Pearson. Pour les données d'imagerie, une méthode d'identification des valeurs aberrantes a été exécutée pour chaque ensemble de données (méthode ROUT), qui est basée sur le taux de fausse découverte. Le taux de fausses découvertes a été défini sur la valeur Q la plus élevée possible (10 %). Dans les ensembles de données dans lesquels des valeurs aberrantes potentielles ont été identifiées, des analyses statistiques ont été effectuées en supprimant toutes les réponses évoquées par les odeurs pour ces mouches. Les analyses avec ou sans valeurs aberrantes n'étaient pas différentes, nous avons donc décidé de conserver et de présenter les ensembles de données complets, qui peuvent contenir des valeurs aberrantes potentielles. L'êta au carré partiel a été utilisé pour rendre compte des tailles d'effet (η2 = 0,01 indique un petit effet ; η2 = 0,06 indique un effet moyen ; η2 = 0,14 indique un effet important) ; la formule utilisée est rapportée dans le tableau des statistiques. Toutes les analyses statistiques sont également rapportées dans le tableau des statistiques dans les informations supplémentaires.

Les expériences ont été randomisées avec des contrôles appropriés présents dans chaque expérience indépendante. Tous les génotypes testés et analysés ont été auto-aveuglés à l'expérimentateur. Plus de détails concernant la conception de la recherche se trouvent dans le résumé du rapport.

Des calculs neuromorphologiques et des analyses de connectivité ont été effectués, et des dendrogrammes ont été calculés et tracés, avec des scripts basés sur les fonctions de la bibliothèque NAVis 1.2.1 dans Python 3.8.8 (https://pypi.org/project/navis/; https://github.com/navis-org/navis)80 et des données de l'hémicerveau de Drosophila (v.1.2.1) (https://neuprint.janelia.org)32,33. Tous les squelettes neuronaux ont été guéris (navis.heal_skeleton (method = "ALL", max_dist = "100 nanometer", min_size = 10)), reracinés (navis.reroot_skeleton (x.soma)) et fortement échantillonnés avec des connecteurs conservés (navis.downsample_neuron(downsampling_factor = 1000, preserve_nodes = 'connectors')).

Des représentations 3D des neurones ombragés par l'ordre de Strahler ont été générées avec navis.plot2d (method='3d', shade_by='strahler_index'), après avoir taillé des brindilles avec un ordre de Strahler de 1 ou moins (navis.prune_by_strahler()). Le cas échéant, seules les branches de volumes spécifiques ont été prises en compte (navis.in_volume()). Les volumes ont été obtenus à partir de neuprint (v.1.2.1) avec fetch_roi(). La connectivité a été analysée à l'aide de neurones non élagués et avec une spécificité de compartiment (navis.in_volume()).

Des scripts personnalisés basés sur navis.plot_flat() ont été utilisés pour générer des dendrogrammes de neurones DPM et APL avec des brindilles d'ordre Strahler de 1 ou moins taillées. Les limites des compartiments MB ont été définies par la connectivité aux DAN des compartiments respectifs. Les branches en dehors du lobe γ ont été réduites manuellement pour augmenter la visibilité des compartiments du lobe γ. Les synapses sont filtrées par in_volume() et affichées sur des branches avec un ordre de Strahler supérieur à 1. Les statistiques de connectivité sont basées sur des neurones non élagués, et les synapses entre neurones ont été obtenues avec des scripts natverse :: neuprint_get_synapses() (https://natverse.org)80 et traitées avec des scripts personnalisés en Python.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles sur https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git. L'ensemble de données pour l'hémicerveau de la drosophile mentionné dans la section « Neuroanatomie, connectivité et dendrogrammes » dans les méthodes est accessible au public sur https://neuprint.janelia.org.

Des scripts MATLAB et Fiji/ImageJ personnalisés sont disponibles sur https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git. Le code mentionné dans la section « Neuroanatomie, connectivité et dendrogrammes » des Méthodes est accessible au public sur https://pypi.org/project/navis/, https://github.com/navis-org/navis et https://natverse.org.

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Nous remercions R. Brain, K. delos Santos, R. Busby, M. Moreno Gasulla, J.-P. Moszynski et F. Woods pour l'assistance technique ; et G. Rubin, FlyLight, B. Dickson, A. Lin et le Vienna Drosophila Resource Center, et le Bloomington Stock Center pour les mouches. ZO a été financé par une bourse postdoctorale à long terme EMBO (ALTF 311-2017). PV-G. a été financé par la bourse Sloane Robinson / Clarendon accordée par le programme Clarendon Fund de l'Université et le Keble College et par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). SW a été financé par une Wellcome Principal Research Fellowship (200846), un Wellcome Discovery Award (225192), une ERC Advanced Grant (789274) et des Wellcome Collaborative Awards (203261 et 209235).

Nils Otto

Adresse actuelle : Institut d'anatomie et de neurobiologie moléculaire, Université de Münster, Münster, Allemagne

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Zeynep Okray, Pedro F. Jacob

Centre for Neural Circuits & Behaviour, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Zeynep Okray, Peter F. Jacob, Ciara Stern, Kieran Desmond, Nils Otto, Clifford B. Talbot, Paola Vargas-Gutierrez et Scott Waddell

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ZO, PFJ, CBT et SW ont conçu la recherche. ZO, PFJ, CS, KD, NO et PV-G. effectué les expériences. ZO, PFJ, CS, KD et NO ont analysé les données. SW a fourni des ressources. SW, ZO, PFJ et NO ont rédigé le manuscrit. SW a supervisé l'étude. SW et ZO ont acquis un financement.

Correspondance à Zeynep Okray ou Scott Waddell.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

un. En haut à gauche, protocoles multisensoriels. Les carrés verts et bleus représentent les couleurs, les carrés gris clair et foncé représentent les odeurs OCT et MCH. Apprentissage visuel (V) : couleurs utilisées comme CS+ et CS−. Apprentissage olfactif (O) : odeurs utilisées comme CS+ et CS−. Protocole congruent (C) : couleurs + odeurs ont été combinées en CS+ et CS−. Mêmes combinaisons couleur + odeur utilisées pendant la formation et les tests. Protocole incongruent (I) : les couleurs + les odeurs ont été combinées en tant que CS + et CS − mais les combinaisons ont été inversées entre l'apprentissage et le test. En bas à gauche, chronologie de la formation et des tests. À droite, performances de la mémoire sur 24 h pour les protocoles V, O, C et I. La combinaison des couleurs + odeurs dans le protocole congruent (C) a amélioré les performances sur 24 h, par rapport à celles obtenues avec un apprentissage V ou O unisensoriel. L'appariement incongru (I) des couleurs et des odeurs a aboli l'amélioration multisensorielle de la mémoire de 24 h. b. A gauche, chronologie de l'entraînement et des tests. Protocoles moyens et multisensoriels. À droite, performances de mémoire immédiates. Les mouches ont montré une mémoire significativement plus élevée après le protocole C que le protocole I. c. A gauche, chronologie de l'entraînement et des tests. Protocoles multisensoriels moyens : protocole C tel que décrit ci-dessus ; Protocole congruent utilisant la même couleur (C−sc) combinée à des odeurs différentes comme CS+ et CS− pendant la formation et les tests. À droite, le protocole C utilisant des combinaisons couleur + odeur distinctes pour CS + vs CS− a entraîné des performances de mémoire immédiate plus élevées que le protocole C-sc utilisant la même couleur avec les deux odeurs. d. A gauche, chronologie de l'entraînement et des tests. Protocoles multisensoriels moyens : Apprentissage olfactif (O) tel que décrit ci-dessus ; Récupération multisensorielle (MSR) : les odeurs étaient CS+ et CS− pendant l'entraînement et ces mêmes odeurs ont été combinées avec des couleurs différentes pendant les tests. À droite, la performance de la mémoire immédiate évoquée par la MSR n'était pas significativement réduite à celle qui suit pour l'apprentissage et la récupération olfactifs. e. A gauche, chronologie de l'entraînement et des tests. Protocoles multisensoriels intermédiaires : protocole congruent (C) tel que décrit ci-dessus ; Récupération des odeurs (OR) : les couleurs + les odeurs étaient CS + et CS − pendant la formation et seules les odeurs ont été utilisées pendant les tests. À droite, les mouches entraînées avec des stimuli multisensoriels ont obtenu de meilleurs résultats si elles étaient testées avec des stimuli multisensoriels congruents par rapport à une seule modalité (dans ce cas, l'odeur). Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. Les groupes ont été comparés à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (a), le test t bilatéral non apparié (b, c, e) et le test U Mann-Whitney bilatéral non apparié (d), les valeurs P exactes et les comparaisons sont données dans Informations supplémentaires. N valeurs pour chaque expérience sont : a, b, e, n = 10 ; c, n = 8 ; d, n = 10 pour OR et n = 8 pour MSR.

un. En haut à gauche, schéma des KC γd. En bas à gauche, chronologie d'entraînement et de test avec température restrictive constante (ligne pointillée). À droite, les performances de la mémoire à 6 h après l'apprentissage olfactif sont inchangées lorsque les KC γd sont bloqués tout au long de l'expérience à l'aide de MB607B-GAL4 ; UAS-Shits1 b et c. Le blocage des KC γd tout au long de l'expérience a considérablement altéré la mémoire dans le protocole Congruent (b). La libération de l'effet d'interférence du protocole Incongruent n'a pas atteint la signification (c). d. En haut à gauche, schéma des KC αβp. En bas à gauche, chronologie d'entraînement et de test avec température restrictive constante (ligne pointillée). À droite, bloquant la sortie αβp KC tout au long de l'expérience en utilisant c708a-GAL4 ; UAS-Shits1 n'a pas altéré l'apprentissage olfactif de 6 h. e et f. Les performances de la mémoire pour les protocoles Congruent (e) et Incongruent (f) ont changé de manière significative lorsque les KC αβp ont été bloqués au cours de l'expérience. g et h. En haut, calendrier d'entraînement et de test avec changement de température (ligne pointillée). Blocage γd (g) et αβp (h) KCs mémoire altérée récupérée avec des repères visuels. je. En haut à gauche, schéma des KC γd. En haut à droite, chronologie d'entraînement et de test avec une température permissive constante (ligne pointillée). il Performances de la mémoire dans MB607B-GAL4 ; Les mouches UAS-Shits1 suivant les protocoles Congruent (i), Incongruent (j), Olfactory Retrieval (k) et Visual Retrieval (l) n'ont pas été affectées lorsque la formation et les tests ont été effectués à 23 ° C. M. En haut à gauche, schéma des KC αβp. En bas à gauche, calendrier d'entraînement et de test avec une température permissive constante (ligne pointillée). Mo Performances de la mémoire dans c708a-GAL4 ; UAS-Shits1 vole après les protocoles Congruent (m), Incongruent (n) et Visual Retrieval (o) n'a pas été affecté lorsque la formation et les tests étaient à 23 ° C. Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. Les groupes ont été comparés à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (ag, io) et du test H de Kruskal-Wallis avec le test de Dunn (h), les valeurs P exactes et les comparaisons sont données dans les informations supplémentaires. N valeurs pour chaque expérience sont : a—c, g, h, n = 12 ; d, n = 12 pour c708a et n = 10 pour tous les autres groupes, f, n = 10 ; io, n = 8.

a et b. En haut à gauche, protocole d'entraînement appétitif et d'imagerie olfactive non apparié. La présentation couleur + odeur n'était pas liée au sucre. En bas à gauche, plan d'imagerie dans la région γ5 (a) et γ1 (b) des KC γd. Au milieu, traces d'activité olfactive CS+ et CS−. Dans les deux régions des KC γd, l'entraînement appétitif multisensoriel non apparié ne modifie pas les réponses olfactives. À droite, quantification des réponses évoquées par les odeurs. c. Réponses évoquées par la couleur (bleu, vert et contrôle, c'est-à-dire LED éteinte) dans la région γ5 des KC γd chez les mouches naïves. L'acquisition des images est interrompue pendant la présentation des couleurs. À droite, la quantification montre des réponses excitatrices aux lumières bleues, vertes et au contrôle (LED éteinte). d et e. La livraison pulsée de lumière colorée n'affecte pas les performances de la mémoire multisensorielle dans le protocole Congruent (d) ou Visual Retrieval (e) après l'apprentissage multisensoriel. Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. f et g. En haut à gauche, chronologies d'entraînement et d'imagerie olfactive multisensorielles (couleur + odeur, f) et unisensorielles (odeur, g). En bas à gauche, Plan d'imagerie dans les somates γd KC. Au milieu, traces d'activité olfactive CS+ et CS−. Les réponses inhibitrices aux odeurs CS+ et CS− (diminution de -ΔF/F0) étaient évidentes selon l'un ou l'autre paradigme. Exact, la quantification. h et moi. En haut à gauche, chronologies d'entraînement multisensoriel appétitif (couleur + odeur) et d'imagerie des odeurs. En bas à gauche, plan d'imagerie dans les régions γ5 (h) et γ1 (i) des γm KC. Au milieu, traces d'activité olfactive CS+ et CS−. Les régions γ1 et γ5 des KC γm montrent une excitation aux odeurs CS+ et CS− (augmentations de -ΔF/F0). Exact, la quantification. Pour toutes les traces et la quantification, la présentation CS+ et CS− impliquait une alternance 50/50 des odeurs comme dans toutes les autres expériences. Les traces d'activité évoquées par l'odeur ou la couleur montrent la moyenne (ligne pleine) avec SEM (ombre). Les lignes pointillées horizontales indiquent l'activité de base. La ligne noire sous les traces marque une exposition aux odeurs de 5 s. En (c) la barre verticale grise correspond aux 0,75 s de présentation des couleurs (lorsque l'acquisition de l'image est obturée) et la case à la période (1,75 s) de quantification. Les astérisques indiquent une différence significative entre les réponses CS+ et CS− moyennes (P < 0,05). Réponses CS+ et CS− pour chaque mouche individuelle reliées par une ligne pointillée. Groupes comparés à l'aide d'un test t bilatéral apparié (a, b, fi), d'un test t à un échantillon (c), d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (d) et d'un test t bilatéral non apparié (e), les valeurs P exactes et les comparaisons sont données dans les informations supplémentaires. Les valeurs N pour chaque expérience sont : a, b, n = 20 mouches ; c, n = 20 mouches pour le vert, n = 20 mouches pour le bleu, n = 6 pour LED éteinte ; d, e, n = 8 ; f, g, n = 22 mouches ; h, je, n = 16 mouches.

un. Calendrier d'entraînement et de test supérieur et aversif. En bas, conditions expérimentales multisensorielles. Les carrés verts et bleus représentent les couleurs, les gris clair et foncé représentent les odeurs OCT et MCH. Apprentissage visuel (V); Apprentissage olfactif (O); Protocole congruent (C) ; Protocole incongru (I) ; Récupération Olfactive (RO); Récupération visuelle (VR). bd. En haut, les délais de formation et de test. En bas, la mémoire aversive avec le protocole C a été significativement augmentée par rapport à celle avec le protocole I à la fois immédiatement (b) et 3 h (c) après l'entraînement. Les mouches dans le protocole C ont surpassé celles testées 3 h après l'apprentissage olfactif (O). Seul le protocole C a généré des performances mémoire significatives sur 24h (d). e et f. En haut, les délais de formation et de test. En bas, lorsqu'elle est testée immédiatement (e), la mémoire multisensorielle récupérée avec des couleurs (VR) est nettement meilleure que celle qui suit l'apprentissage visuel unisensoriel (V). À 3 h (f), les mouches entraînées multisensorielles ont obtenu de meilleurs résultats lorsque leur mémoire a été récupérée avec uniquement des signaux olfactifs (OR) ou visuels (VR) que les mouches entraînées avec un apprentissage olfactif (O) ou visuel (V) unisensoriel. g. En haut à gauche, schéma des KC γd. En bas à gauche, calendrier d'entraînement et de test avec changement de température (ligne pointillée). gi. Blocage de la sortie des KC γd pendant les tests à l'aide de MB607B-GAL4 ; UAS-Shits1 modifie les performances de la mémoire de 3 h dans les protocoles Congruent (g), Incongruent (h) et Olfactory Retrieval (i). J. En haut à gauche, schéma des KC γd. En bas à gauche, calendrier d'entraînement et de test avec une température permissive constante (ligne pointillée). jl Performances de la mémoire dans MB607B-GAL4 ; Les mouches UAS-Shits1 après les protocoles Congruent (j), Incongruent (k) et Olfactory Retrieval (l) n'ont pas été affectées lorsque les mouches ont été entraînées et testées à 23 ° C. Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. m et n. En haut à gauche, protocole d'entraînement aversif unisensoriel et d'imagerie olfactive. En bas à gauche, plan d'imagerie dans la région γ1 (m) et γ5 (n) des KC γd. Au milieu, traces d'activité olfactive CS+ et CS−. l'entraînement aversif uniisensoriel ne modifie pas les réponses olfactives dans l'une ou l'autre des régions γd KC. Exact, la quantification. o et p. En haut à gauche, protocole d'entraînement multisensoriel aversif non apparié et d'imagerie des odeurs. La présentation couleur + odeur n'était pas liée au choc. En bas à gauche, plan d'imagerie dans la région γ1 (o) et γ5 (p) des KC γd. Au milieu, traces d'activité olfactive CS+ et CS−. L'entraînement aversif multisensoriel non apparié ne modifie pas les réponses olfactives dans les deux régions γd KC. Exact, la quantification. Pour toutes les traces et la quantification, la présentation CS+ et CS− impliquait une alternance 50/50 des odeurs comme dans toutes les autres expériences. Les traces d'activité évoquées par les odeurs montrent la moyenne (ligne pleine) avec SEM (ombre). Les lignes pointillées horizontales indiquent l'activité de base. La ligne noire sous les traces marque une exposition aux odeurs de 5 s. Les astérisques indiquent une différence significative entre les réponses CS+ et CS− moyennes (P < 0,05). Réponses CS+ et CS− pour chaque mouche individuelle reliées par une ligne pointillée. Les groupes ont été comparés en utilisant l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (bd, gl), le test t bilatéral non apparié (e, f) et le test t bilatéral apparié (mp), les valeurs P exactes et les comparaisons sont données dans Informations supplémentaires. Les valeurs N pour chaque expérience sont : b, g, il, n = 8 ; c, e, f, h, n = 10 ; d, n = 12 ; m, n, n = 22 mouches ; o, p, n = 24 mouches.

un. Une projection de dendrogramme bidimensionnelle des neurites de neurones DPM (nuances de sarcelle). La branche dorsale des compartiments γ2-γ5 du lobe horizontal est bleu sarcelle foncé, le reste des projections du lobe γ est bleu sarcelle moyen et celles des autres lobes sont bleu sarcelle plus clair. Remarque : tous les neurites du lobe sauf γ sont réduits pour la visibilité. Les neurites avec l'ordre de Strahler <1 sont élagués et la connectivité est indiquée en conséquence. Les projections dans le compartiment γ1 sont marquées et divisées dans les compartiments γ2-5 en branches dorsale et ventrale. Le marquage est conforme à la connectivité DAN (zones grisées). Les synapses (sphères) ne sont marquées que dans les compartiments du lobe γ. La structure de connectivité montre les entrées des KC γd (sphères jaunes) et les sorties vers les KC γm (sphères grises) colocalisent sur des branches spécifiques au compartiment des neurones DPM. Les entrées APL (magenta) sont réparties sur les branches dorsale et ventrale et concentrées autour du point de ramification à la base des lobes verticaux dans le compartiment α'1 (astérisque). Remarque : Certaines parties putatives de la branche dorsale du lobe γ n'ont pas pu être attribuées à un compartiment en raison du manque d'entrée DAN. Une branche qui porte les synapses γ KC (hashtag) a été identifiée comme la branche du lobe β 'qui pénètre dans le MB près de la ligne médiane. Il est probable que d'autres pointes de neurites DPM qui ont des synapses γ KC sont des artefacts où la guérison a fusionné des rameaux de lobe γ flottants avec des neurites DPM innervant les autres lobes. b. Une projection de dendrogramme bidimensionnelle des neurites de neurones APL (magenta). Remarque : Les neurites avec l'ordre de Strahler <1 ont été élagués et la connectivité est indiquée en conséquence. Comparer avec (a). Les synapses d'entrée PPL1-γ1pedc et PAM-γ5 DAN (sphères rouges et vertes respectivement) sont marquées dans les compartiments γ1 et γ5 (zones ombrées). Les synapses des neurones DPM (sphères sarcelles) colocalisent avec l'entrée DAN.

a et b. En haut, Anatomie du neurone APL. Calendriers d'entraînement et de test avec une température restrictive constante (ligne pointillée). En bas, suppression de Dop2R par ARNi restreinte aux adultes dans les neurones APL à l'aide de tubPGAL80ts ; VT43924-GAL4.2 a altéré les performances de mémoire de récupération olfactive de 6 h après un entraînement appétitif multisensoriel (a) et une mémoire réduite après un apprentissage olfactif unisensoriel (b). c et d. Expériences de contrôle de température permissive (23 °C) pour (a) et (b). En haut, calendriers de formation et de test avec changement de température (ligne pointillée). Les performances de la mémoire n'ont pas été affectées dans tubPGAL80ts;VT43924-GAL4.2, mouches UAS-Dop2R RNAi après récupération olfactive (c) et apprentissage olfactif (d) lorsque les mouches ont été élevées, entraînées et testées à 23 ° C. e et f. En haut, calendriers d'entraînement et de test avec température (ligne pointillée). En bas, 6 h Olfactive La récupération de la mémoire multisensorielle appétitive (e) et de la mémoire après l'apprentissage olfactif (f) n'a pas été affectée par l'inactivation de DopEcR par ARNi restreinte aux adultes dans les neurones APL à l'aide de tubPGAL80ts ; VT43924-GAL4.2. Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. Tous les groupes ont été comparés à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey, les valeurs P exactes et les comparaisons sont données dans les informations supplémentaires. N valeurs pour chaque expérience sont : a, b, n = 12 ; c, ré, n = 8 ; e, f, n = 10.

un. Expérience de contrôle de la température permissive (23 ° C) pour la Fig. 5c, d. En haut, chronologie de la formation et des tests. En bas, performances de la mémoire multisensorielle évoquées par Olfactory Retrieval de VT64246-GAL4 ; Les mouches UAS-Shits1 n'ont pas été affectées lorsque les mouches ont été entraînées et testées à 23 ° C. b. En haut, calendrier d'entraînement et de test avec changement de température (ligne pointillée). En bas, le blocage de la sortie des neurones DPM pendant les tests a nui à la récupération visuelle de la mémoire multisensorielle. c. Expérience de contrôle de la température permissive (23 ° C) pour les données étendues Fig. 7b. En haut, chronologie de la formation et des tests. En bas, performances de mémoire multisensorielle évoquées par Visual Retrieval de VT64246-GAL4 ; Les mouches UAS-Shits1 n'ont pas été affectées lorsque les mouches ont été entraînées et testées à 23 ° C. d. En haut, calendrier d'entraînement et de test avec changement de température (ligne pointillée). En bas, le blocage de la sortie des neurones DPM pendant l'entraînement et les tests unisensoriels n'a pas affecté les performances d'apprentissage olfactif. e. En haut à gauche, schéma des γ KCs. par exemple. En haut, calendrier d'entraînement et de test avec changement de température (ligne pointillée). En bas, blocage de la sortie des KC γ pendant l'entraînement à l'aide de MB009B-GAL4 ; UAS-Shits1 n'a pas affecté les performances d'apprentissage olfactif de 6 h (e), tandis que les performances de mémoire de récupération olfactive (f) et de récupération visuelle (g) ont été considérablement altérées. h et moi. Expériences de contrôle de la température permissive (23 ° C) pour les données étendues Fig. 7f, g. En haut, les délais de formation et de test. En bas, performances de la mémoire multisensorielle évoquées par Olfactory Retrieval (h) ou Visual Retrieval (i) de MB009B-GAL4 ; Les mouches UAS-Shits1 n'ont pas été affectées lorsque les mouches ont été entraînées et testées à 23 ° C. j et k. À gauche, chronologie de l'entraînement unisensoriel appétitif (odeur) et de l'imagerie olfactive. Plans d'imagerie dans les régions γ5 (j) et γ1 (k) du neurone DPM. Exact, la quantification. 6 h après l'entraînement olfactif, les régions γ5 (j) et γ1 (k) des neurones DPM ont montré des réponses excitatrices indiscernables aux odeurs CS + et CS−. k et l. En haut, entraînement multisensoriel appétitif (couleur + odeur) ou unisensoriel (odeur) et chronologies d'imagerie des odeurs. Plan d'imagerie dans la région γ5 des neurones DPM. En bas, la quantification des réponses γ5 des neurones DPM 1 h après l'entraînement multisensoriel (l) et unisensoriel (m) a montré une réponse excitatrice améliorée aux odeurs CS + par rapport aux odeurs CS−. n et o. En haut, entraînement multisensoriel appétitif (couleur + odeur) ou unisensoriel (odeur) et chronologies d'imagerie des odeurs. Plan d'imagerie dans la région γ1 du neurone DPM. En bas, la quantification des réponses γ1 des neurones DPM 1 h après l'entraînement multisensoriel (n) et unisensoriel (o) n'a montré aucune différence entre les réponses excitatrices aux odeurs CS + et CS−. p et q. En haut, plan d'imagerie dans la région γ1 (p) et γ5 (q) des KC γd. Panneaux en bas à gauche, un enregistrement de base dans une solution saline (300 s ; non illustré) a été suivi d'une perfusion de 100 μM de 5-HT pendant 300 s, puis d'un lavage dans une solution saline pendant 300 s. Des traces moyennes pour l'application du bain et le lessivage sont indiquées. À droite, la quantification montre des réponses excitatrices à l'application de 5-HT dans les deux régions (moyenne accrue -ΔF/F0), par rapport à la ligne de base (pré) et après lavage. r. En haut à gauche, schéma des KC γd. En bas à gauche, chronologie de la formation et des tests. À droite, 6h Les performances d'apprentissage olfactif ne sont pas affectées chez les mouches avec un knockdown ARNi de 5-HT2A avec MB607B-GAL4. Les astérisques indiquent des différences significatives (P < 0,05). Données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les points de données individuels affichés sous forme de points correspondent à des expériences indépendantes. s. À gauche, entraînement multisensoriel appétitif (couleur + odeur) et chronologie de l'imagerie couleur. Plan d'imagerie dans la région γ5 des axones γd KC. Au milieu, traces d'activité évoquée par la couleur CS+ et CS−. La région γ5 des axones γd KC a montré des réponses excitatrices aux couleurs CS + et CS−. À droite, quantification des réponses évoquées par la couleur. Pour la trace en (s) et toutes les quantifications, la présentation CS+ et CS- implique une alternance 50/50 des odeurs et/ou des couleurs comme dans toutes les autres expériences. Les traces d'activité évoquées par la couleur montrent la moyenne (ligne continue) avec SEM (ombre). En (s) la barre verticale grise correspond à la présentation couleur de 0,75 s (lorsque l'acquisition d'image est obturée) et la case à la période de quantification de 1,75 s. Les lignes pointillées horizontales indiquent l'activité de base. Les astérisques indiquent une différence significative entre les réponses CS+ et CS− moyennes (P < 0,05). Réponses CS+ et CS− pour chaque mouche individuelle reliées par une ligne pointillée. Les groupes ont été comparés en utilisant l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (ae, gi, r), le test H de Kruskal-Wallis avec le test de Dunn (f), le test t bilatéral apparié (jo, s) et les mesures répétées ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey (p, q), les valeurs P exactes et les comparaisons sont données dans les informations supplémentaires. Les valeurs N pour chaque expérience sont : ac, r, n = 8 ; d, n = 12 ; ei, n = 8 ; j, k, n, n = 18 mouches ; l, m, o, s, n = 16 mouches ; o, p, n = 10.

n valeurs, statistiques descriptives et analyses statistiques avec des valeurs P exactes pour les Figs. 1–5.

n valeurs, statistiques descriptives et analyses statistiques avec des valeurs P exactes pour les données étendues Figs. 1–7.

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Réimpressions et autorisations

Okray, Z., Jacob, PF, Stern, C. et al. L'apprentissage multisensoriel lie les neurones dans un engramme de mémoire intermodal. Nature 617, 777–784 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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Reçu : 07 juillet 2022

Accepté : 24 mars 2023

Publié: 26 avril 2023

Date d'émission : 25 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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