Développement de la microglie

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1224 (2022) Citer cet article

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Nous décrivons ici les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant la microglie contenant une région promotrice putative de 1,7 kb de la molécule d'adaptateur de liaison au calcium ionisé spécifique de la microglie / macrophage 1 (Iba1), ainsi que des sites cibles miARN répétés pour le microARN (miR )-9 et miR-129-2-3p. La séquence génomique de 1,7 kb en amont du codon de départ dans l'exon 1 du gène Iba1 (Aif1) fonctionne comme promoteur préférentiel de la microglie dans le striatum et le cervelet. De plus, l'expression du transgène ectopique dans les cellules non microgliales est nettement supprimée lors de l'ajout de deux ensembles de sites cibles de miARN à 4 répétitions pour miR-9 et miR-129-2-3p, qui sont exprimés exclusivement dans les cellules non microgliales et l'AAV épongé. ARNm dérivés. Nos vecteurs ont transduit des microglies ramifiées dans des tissus sains et des microglies réactives chez des souris traitées avec des lipopolysaccharides et un modèle murin de maladie neurodégénérative. De plus, l'imagerie fluorescente en direct a permis le suivi de la motilité microgliale et de la mobilisation intracellulaire du Ca2+. Ainsi, les vecteurs AAV ciblant la microglie sont précieux pour étudier la physiopathologie et les thérapies microgliales, en particulier dans le striatum et le cervelet.

La microglie, qui sont des cellules immunitaires qui résident dans le système nerveux central (SNC), est connue pour fournir des fonctions de surveillance et de nettoyage. Cependant, des études plus récentes ont révélé diverses fonctions de la microglie dans le SNC, notamment le développement du cerveau1,2, le remodelage des circuits neuronaux1,3 et la progression des maladies neurodégénératives4,5,6.

Les avancées technologiques récentes ont permis l'expression virale de diverses molécules fonctionnelles étiquetées avec des protéines fluorescentes, telles que G-CaMP (capteur de calcium)7 et ArcLightning (capteur de tension membranaire)8 pour l'enregistrement optique et divers canaux ioniques sensibles à la lumière pour l'optogénétique9. Dans ces circonstances, les vecteurs viraux qui transduisent spécifiquement les cellules microgliales dans le cerveau in vivo sont des outils puissants pour explorer la fonction et le comportement de la microglie dans l'environnement cérébral natif. De plus, la microglie est chimioattirée vers les sites de lésion dans le cerveau ; 10,11,12 ainsi, la microglie transduite peut être exploitée pour délivrer un produit génique thérapeutique au tissu lésé.

Pour délivrer un transgène à la microglie in vivo, le groupe de Jakobsson a utilisé des vecteurs lentiviraux avec un promoteur domestique de phosphoglycérate kinase (PGK) et quatre séquences répétées complémentaires de microARN-9-cible (miR-9.T)13. Étant donné que miR-9 était exprimé de manière endogène dans des cellules non microgliales mais pas dans la microglie, l'ARN messager transgénique (ARNm) contenant miR-9.T a été épongé exclusivement dans des cellules non microgliales, conduisant à l'expression sélective du transgène dans la microglie. Là-dessus, plus de 70% des cellules transduites dans le striatum du rat se sont révélées être de la microglie13. Cependant, le passage du promoteur PGK à un promoteur puissant du cytomégalovirus (CMV) dans la cassette transgénique des vecteurs lentiviraux provoque une fuite importante de l'expression du transgène dans les neurones et les astrocytes14. De plus, des études pertinentes ont montré l'induction de miR-9 dans la microglie lors de leur activation15,16,17, suggérant la suppression possible de l'expression du transgène dans la microglie réactive.

Des études antérieures ont contesté la transduction de la microglie à l'aide de vecteurs de capside de sérotype 2, 5 et mutant 6 du virus adéno-associé (AAV) comprenant des promoteurs spécifiques de la microglie, tels que ceux de F4/80 et CD6818,19. Ils n'ont cependant abouti qu'à un succès mineur avec un "ciblage unique de la microglie", probablement en raison de la faible activité du promoteur et de la faible capacité de liaison des capsides d'AAV à la microglie. Ainsi, pour la transduction efficace et sélective de la microglie, un promoteur robuste spécifique de la microglie et une capside AAV tropique de la microglie sont nécessaires. Parmi les types de capsides d'AAV naturellement isolés, AAV1 et AAV9 dans le cortex cérébral et AAV1 dans le striatum ont provoqué une expression transgénique élevée dans la microglie. Cependant, en plus de la microglie, AAV1 dans le striatum a également montré une préférence pour les astrocytes et les neurones20.

Dans cette étude, nous avons développé des vecteurs AAV2/9 ciblant la microglie (capside AAV9 et génome viral AAV2) portant une région promotrice putative de la molécule 1 (Iba1) adaptatrice de liaison au calcium ionisée spécifique à la microglie/macrophage, miR-9.T, et des séquences cibles supplémentaires liées de manière complémentaire par miR-129-2-3p, un miARN différent qui a été exprimé sélectivement dans les populations de cellules non microgliales du SNC21,22,23.

Pour tester le ciblage microglial, nous avons produit cinq constructions AAV portant le promoteur PGK ou le promoteur putatif Iba1 avec ou sans séquences cibles miARN quadruples pour miR-9, miR-129-2-3p ou miR-136-5p, comme illustré (Fig. 1a -e). Les profils de ciblage de la microglie de ces constructions AAV ont été évalués dans trois régions cérébrales différentes : le cortex cérébral (cortex frontal), le striatum et le cervelet. Le striatum a été sélectionné pour comparer nos résultats avec un rapport précédent utilisant des vecteurs lentiviraux avec miR-9.T13, tandis qu'avec le striatum, le cortex frontal et le cervelet ont été choisis car la fonction microgliale aberrante dans ces régions du cerveau a été associée à divers troubles neurodégénératifs , comme la maladie d'Alzheimer et les ataxies cérébelleuses24,25,26. Généralement, le profil d'expression du transgène de l'AAV dépend de la dose d'injection et de la période d'incubation ultérieure. Pour dépister les propriétés de ciblage de la microglie, nous avons attendu une semaine après l'injection d'AAV à un titre relativement élevé (3,9 × 1012 génome viral (vg) / ml ; Fig. 1f). Le volume d'injection (0,5 μL pour le cortex cérébral, 1 μL pour le striatum et 10 μL pour le cervelet) a été déterminé par plusieurs essais d'injection préliminaires en référence à des rapports antérieurs13,27. Après avoir choisi la construction AAV la plus appropriée pour le ciblage de la microglie, la période d'incubation a été prolongée en abaissant la dose d'injection pour optimiser la spécificité de transduction microgliale.

a–e Les vecteurs AAV comprennent le promoteur constitutif PGK (a) ou le promoteur Iba1 (b–e) suivi de GFP, WPRE et polyA. De plus, un ou deux ensembles de quatre séquences cibles répétées de microARN (miR) (4 × miR-9.T et 4 × miR-129-2-3p.T ou 4 × miR-136-5p.T) ont été insérés entre les séquences WPRE et polyA (a, c–e). Chaque construction a été étiquetée avec le nom abrégé du promoteur (PGK ou Iba1) plus la ou les cibles miR incorporées comme décrit. f Les souris ont reçu différentes doses de chaque vecteur AAV (3,9 × 1012 vg/mL) dans le cortex cérébral (0,5 μL), le striatum (1 μL) et le cervelet (10 μL). Une semaine après l'injection virale, les cerveaux des souris traitées ont été examinés par immunohistochimie. Protéine fluorescente verte améliorée par GFP, molécule adaptatrice 1 de liaison au calcium ionisée Iba1, immunohistochimie IHC, répétition terminale inversée ITR, PGK phosphoglycérate kinase 1, séquence signal de polyadénylation du virus polyA simien 40, élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l'hépatite de la marmotte WPRE.

Une étude précédente a montré que l'injection de vecteurs lentiviraux exprimant quatre copies répétées de miR-9.T par le promoteur PGK dans le striatum du rat adulte entraînait la transduction prédominante de la microglie13. Les vecteurs AAV2/9 portant la cassette du transgène, qui étaient essentiellement identiques aux vecteurs lentiviraux (AAV9.PGK.miR-9.T ; Fig. 1a), ont été injectés dans le cortex cérébral, le striatum et le cervelet. Une semaine après l'injection, les cerveaux ont été tranchés et immunomarqués pour GFP et Iba1. Nous avons constaté que la majorité des cellules exprimant la GFP avaient des morphologies distinctes de la microglie ramifiée et n'étaient pas co-immunomarquées avec Iba1 (Fig. 1 supplémentaire). L'analyse quantitative a montré que les rapports entre les cellules positives pour GFP et Iba1 et les cellules positives pour GFP étaient d'environ 10% ou moins dans le cortex cérébral et le striatum et de 34% dans le cervelet (tableau 1 et Fig. 1c supplémentaire).

Auparavant, nous avons ciblé avec succès des populations cellulaires spécifiques à l'aide de vecteurs AAV avec des promoteurs spécifiques au type de cellule, tels que le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) (astrocytes)28, le promoteur de l'énolase spécifique des neurones (NSE) (neurones)29, L7-6 promoteur [cellules cérébelleuses de Purkinje (PC)]30 et promoteur de la décarboxylase de l'acide glutamique de souris (GAD) 65 (mGAD65) (neurones inhibiteurs)27. Notamment, nous avons constaté que la séquence du génome en amont du premier ATG d'un gène spécifique de type cellulaire sert souvent de promoteur spécifique de type cellulaire27,30. Par conséquent, nous avons décidé de profiter de cette stratégie. Une étude précédente a utilisé une région génomique Iba1 (Aif1) de 1,9 kb contenant l'exon 1, l'intron 1 et une partie de l'exon 2 pour produire des souris transgéniques spécifiques à la microglie (Fig. 2a supplémentaire)31. Ainsi, nous avons testé si la région génomique correspondante en amont du premier ATG dans l'exon 1 du gène Iba1 (Fig. 2a, b supplémentaire) fonctionnait de manière spécifique à la microglie lorsqu'elle était incorporée dans des vecteurs AAV (ci-après, la souris Iba1 de 1678 pb région génomique est appelée promoteur Iba1). Des vecteurs AAV2/9 exprimant la GFP via le promoteur Iba1 (AAV9.Iba1) ont été injectés dans le cortex cérébral, le striatum et le cervelet à la même dose que l'AAV9.PGK.miR-9.T (Fig. 1b, f).

Une semaine après l'injection, une transduction efficace de la microglie (cellules doublement positives GFP et Iba1) a été observée dans le striatum et le cervelet (Fig. 3e – g et h – j supplémentaires), avec quelques cellules non microgliales Iba1 négatives transduites ( flèches dans la Fig. supplémentaire 3f, g, i, j). En revanche, la plupart des cellules exprimant la GFP dans le cortex cérébral étaient des cellules de type neurone pyramidal négatives pour Iba1 (Fig. 3b – d supplémentaires). L'analyse quantitative a montré qu'environ 69 % et environ 86 % des cellules GFP-positives dans le striatum et le cervelet, respectivement, étaient des microglies Iba1-positives, alors que les microglies Iba1-positives ne conservaient que 2 % des cellules exprimant la GFP dans le cortex cérébral (tableau 1 et Fig. 3k supplémentaire). Ces résultats suggèrent que le promoteur Iba1 agit préférentiellement dans la microglie résidente du striatum et du cervelet mais pas dans le cortex cérébral.

Nous avons ajouté des séquences miR-9.T à AAV9.Iba1 après l'élément de régulation post-transcriptionnelle (WPRE) du virus de l'hépatite de la marmotte (AAV9.Iba1.miR-9.T; Fig. 1c et Fig. 4a supplémentaire). La séquence cible miR a été répétée quatre fois car les rapports précédents ont démontré que les niveaux de suppression de cible augmentaient à mesure que le nombre de sites cibles miR augmentait32,33,34. L'efficacité de chaque site cible miR dans la construction avec quatre cibles miR était deux fois supérieure à celle de chaque site dans la construction avec deux sites cibles miR, mais était similaire à celle de la construction avec six sites cibles miR35. Nous avons choisi une répétition à quatre reprises en termes d'efficacité pour la suppression de la cible et d'économie d'espace d'hébergement pour un transgène.

L'AAV a transduit efficacement la microglie ramifiée dans les trois régions du cerveau (Fig. 4b – j supplémentaires). Cependant, dans le cortex cérébral, de nombreuses cellules non microgliales Iba1 négatives, caractérisées par de grands somates, ont été transduites autour de l'épicentre du site d'injection virale (Fig. 4b, d supplémentaires), alors qu'une transduction microgliale sélective a été observée dans une région éloignée. de l'épicentre (Fig. 4b, c supplémentaires). L'analyse quantitative a révélé que presque toutes les cellules GFP-positives du striatum et du cervelet étaient des microglies Iba1-positives, alors que le rapport entre la microglie transduite et le nombre total de cellules transduites n'était que d'environ 27% dans le cortex cérébral (tableau 1 et Fig. 4k supplémentaire). Par conséquent, l'ajout de la séquence miR-9.T a significativement déciblé les cellules non microgliales dans les trois régions du cerveau, bien que le déciblage non microglial dans le cortex cérébral soit resté insuffisant.

Pour supprimer davantage l'expression du transgène dans les cellules non microgliales, nous avons incorporé une cible microARN-129-2-3p quadruplex supplémentaire (miR-129-2-3p.T) ou une cible microARN-136-5p (miR-136-5p.T ) séquences après quadruplex miR-9.T (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T ou 136-5p.T) (Fig. 1d, e). Semblable à miR-9, miR-129-2-3p et miR-136-5p se sont avérés enrichis dans les neurones et diminués dans la microglie22, ce qui suggère que miR-129-2-3p et miR-136-5p suppriment probablement l'expression d'un ARNm transgénique contenant des sites cibles de miARN dans des cellules non microgliales. Nous avons injecté ces AAV de la même manière dans trois zones cérébrales différentes et avons analysé par immunohistochimie les profils d'expression du transgène 1 semaine après l'injection virale. L'analyse par microscopie confocale des tranches de cerveau traitées avec AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T a révélé une transduction microgliale hautement spécifique dans les trois régions cérébrales (Fig. 2a – j). Notamment, les neurones du cortex cérébral ont été largement déciblés (Fig. 2b – d). L'analyse quantitative a montré qu'environ 87 % des cellules transduites dans le cortex cérébral et presque toutes les cellules transduites dans le striatum et le cervelet étaient des microglies (tableau 1). Contrairement à miR-129-2-3p.T, l'ajout de miR-136-5p.T à AAV9.Iba1.miR-9.T n'a pas réussi à éliminer les cellules non microgliales du cortex cérébral (Fig. 5 supplémentaire ).

un schéma de la construction AAV comprenant le promoteur Iba1, GFP et deux séquences quadruplex différentes complémentaires de miR-9 et miR-129-2-3p. Les souris ont reçu différentes doses d'AAV (3,9 × 1012 vg/mL) dans le cortex cérébral (0,5 μL), le striatum (1 μL) et le cervelet (10 μL). Une semaine après l'injection virale, les cerveaux de souris ont été examinés par immunohistochimie. (bd)Immunohistochimie du cortex cérébral. Les régions carrées en b ont été agrandies. Notez l'expression forte et efficace de la GFP dans la microglie avec une transduction faible et rare de cellules non microgliales Iba1 négatives (flèches). e–j Transduction hautement spécifique de la microglie dans le striatum (e–g) et le cervelet (h–j). Les régions carrées en (e, h) ont été agrandies. Barres d'échelle ; 100 μm (b, e, h) et 20 μm (c, d, f, g, i, j). Couche cellulaire granulaire GL, couche moléculaire ML.

Ensuite, nous avons examiné l'efficacité de transduction de la microglie, qui a été évaluée en divisant le pourcentage de cellules doublement positives GFP et Iba1 (microglie transduite) par le nombre total de microglies immunoréactives pour Iba1. Les vecteurs AAV à la dose testée ont transduit environ 50 à 90% de la microglie dans les trois régions du cerveau (Fig. 6 supplémentaire). En présence de miR-9.T, l'efficacité de transduction a été significativement augmentée en passant du promoteur PGK au promoteur Iba1 dans le cortex cérébral et le striatum. L'ajout de miR-129-2-3p.T à AAV9.Iba1.miR-9.T n'a pas affecté l'efficacité de la transduction dans les trois régions cérébrales examinées.

L'injection parenchymateuse directe d'AAV altère la microvascularisation cérébrale, ce qui peut provoquer l'entrée de monocytes Iba1 positifs dérivés du sang dans le tissu cérébral. Pour vérifier si les cellules marquées à la GFP contenaient ces monocytes infiltrants, AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T a été injecté dans le striatum et le cervelet, comme illustré à la Fig. 2. Une semaine après la les sections d'injection, striatales et cérébelleuses ont été triplement immunomarquées pour la GFP, Iba1 et la protéine transmembranaire 119 (TMEM119), un marqueur microglial hautement spécifique qui n'est pas exprimé par les macrophages du SNC, les cellules dendritiques, les monocytes infiltrants ou d'autres types de cellules immunitaires ou neurales36 (Fig. . 7). Nous avons examiné les cellules doublement positives GFP et Iba1 (n = 299 cellules dans les cinq sections striatales de trois souris et n = 207 cellules dans trois sections cérébelleuses de deux souris), qui se sont également révélées positives pour TMEM119, indiquant peu ou pas de contamination des monocytes infiltrants dans les tissus cérébraux injectés avec AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T.

De plus, pour confirmer que les cellules transduites n'étaient pas des astrocytes, des sections striatales et cérébelleuses ont été immunocolorées pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), un marqueur des astrocytes (Fig. 8 supplémentaire). Nous avons soigneusement recherché des cellules doublement positives GFP et GFAP (astrocytes) (cinq sections striatales de trois souris et trois sections cérébelleuses de deux souris), mais nous n'avons pas pu trouver de telles cellules.

Nous avons examiné le profil de transduction trois semaines après l'injection d'AAV (Fig. 3a). Dans le striatum, la transduction ciblée sur la microglie a été préservée avec une faible expression de GFP dans les cellules non microgliales (Fig. 3b). Plus de 80 % des cellules GFP-positives étaient des microglies Iba1-positives (80,6 ± 1,5 % ; 2061 cellules dans 2576 cellules GFP-positives, n = 9 souris) (Fig. 3g). Cependant, dans le cervelet, la spécificité pour la microglie a diminué à environ 60 % (56,1 ± 5,2 % ; 896 microglies dans 1 637 cellules GFP-positives, n = 7 souris) (Fig. 3c, g). Étant donné que le cervelet a reçu une dose d'AAV 10 fois plus élevée que le striatum, nous avons réduit la dose d'injection à un quart (de 3,9 × 1010 vg/souris à 1,0 × 1010 vg/souris), ce qui a entraîné une augmentation significative de la microglie spécificité à 83 % (82,5 ± 4,9 %, 890 cellules dans 1 067 cellules GFP-positives, n = 7 souris) (Fig. 3d, g).

une construction AAV (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) et schéma de l'injection de virus. Les souris ayant reçu une injection d'AAV dans trois régions du cerveau à la même dose que sur la Fig. 2 (dose élevée; H) ou environ un quart (dose faible; L) ont été examinées 3 semaines après l'injection par immunohistochimie. b–f Immunohistochimie du striatum (b), du cervelet (c, d) et du cortex cérébral (e, f). Les doses injectées ont été décrites au-dessus des schémas. Notez l'expression forte et efficace de la GFP dans la microglie avec une faible transduction des cellules non microgliales Iba1 négatives dans le striatum et le cervelet (b, c). En revanche, le cortex cérébral a montré l'expression de la GFP principalement dans les cellules non microgliales, y compris celles présentant une morphologie de type neurone pyramidal (e). L'abaissement de la dose virale à un quart a supprimé l'expression de la GFP dans les cellules non microgliales du cervelet et du cortex cérébral (d, f). Barres d'échelle ; 100 μm. g Graphique récapitulatif montrant la spécificité cellulaire pour la microglie dans les trois régions du cerveau. Les nombres au-dessus du graphique représentent les doses relatives d'AAV injectées lorsque la dose injectée dans le striatum est prise égale à 1. Les diagrammes en boîte et moustaches affichent la médiane (ligne centrale), le 25e au 75e centile (boîte) et les valeurs minimales à maximales (moustaches). ) (striatum, n = 9 souris par groupe ; cervelet, n = 7 souris par groupe, test t bilatéral non apparié, t(12) = 3,711, **P ≤ 0,01 pour dose élevée vs faible dose ; cortex cérébral , n = 4 souris par groupe, test t bilatéral non apparié, t(6) = 4,513, **P ≤ 0,01 pour dose élevée vs faible dose).

Dans le cortex cérébral, une incubation de trois semaines a entraîné une transduction étendue de cellules non microgliales (4,0 ± 1,3 %, 29 microglies dans 718 cellules GFP-positives, n = 4 souris ; Fig. 3e, g), même si le cortex cérébral reçu la plus faible dose d'AAV. Une réduction supplémentaire de la dose d'injection à un quart (de 1,95 × 109 vg/souris à 0,5 × 109 vg/souris) a augmenté de manière significative la spécificité microgliale, mais est toujours restée aussi faible que 27,3 ± 3,5 % (369 cellules dans 1316 cellules GFP-positives, n = 8 souris ; Fig. 3f, g). Ces résultats suggèrent que la microglie dans le striatum et le cervelet peut être transduite de manière stable avec une grande spécificité en choisissant la dose d'injection optimale ; cependant, il est encore difficile de supprimer l'expression du transgène dans les cellules non microgliales du cortex cérébral.

Des études antérieures ont rapporté l'induction de la production de miR-9 après un traitement au lipopolysaccharide (LPS) dans la microglie17 et les monocytes15. Si tel est le cas, l'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T peut ne pas être utile dans la microglie réactive activée par le LPS. Pour valider cette hypothèse, nous avons injecté AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T à haute dose initiale (cortex cérébral, 1,95 × 109 vg/souris ; striatum, 3,9 × 109 vg/souris ; cervelet, 3,9 × 1010 vg/souris) avec du LPS (0,2 µg/µL) chez des souris adultes, suivi d'une injection intrapéritonéale de LPS (1 µg/g de poids corporel) tous les jours pendant une semaine (Fig. 4a). Les souris ont été sacrifiées pour l'immunohistochimie. Nous avons observé une expression robuste de la GFP dans de nombreuses microglies dans les trois régions du cerveau (Fig. 4b – m). La microglie transduite chez les souris traitées au LPS était de forme amiboïde, avec des processus plus courts et plus épais. Ces résultats indiquent la transduction efficace de la microglie réactive, ainsi que de la microglie ramifiée, par AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T.

un schéma illustrant le protocole expérimental. Une solution contenant AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T et LPS (0,2 μg/μL) a été injectée dans les trois régions du cerveau au jour 0, suivie d'une injection intrapéritonéale supplémentaire de LPS (1 μg/g de poids corporel) quotidiennement jusqu'au jour 7. Les souris ont été tuées 6 h après l'injection de LPS le jour 7. Des tranches de cerveau ont été immunomarquées pour GFP et Iba1. b–m Grossissement faible, moyen et élevé du cortex cérébral (b–e), du striatum (f–i) et du cervelet (j–m). Les régions carrées en (b), (f) et (j) ont été agrandies en (c), (g) et (k), respectivement. Barres d'échelle : 500 μm (b, f, j), 200 μm (c, g, k) et 20 μm (d, e, h, i, l, m). Couche cellulaire granulaire GL, lipopolysaccharide LPS, couche moléculaire ML.

La microglie reconnaît la structure spécifique du LPS via TLR4 (récepteur Toll-like 4), conduisant à la libération de cytokines pro-inflammatoires, tandis que la microglie dans les tissus neurodégénératifs est probablement stimulée via des récepteurs charognards, qui induisent la phagocytose des débris cellulaires apoptotiques et la libération de cytokines anti-inflammatoires37. Ainsi, la microglie réactive dans les tissus neurodégénératifs peut produire des miARN distincts de ceux de la microglie exposée au LPS. Nous avons ensuite examiné si l'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T peut être utilisé pour la transduction de la microglie dans les tissus neurodégénératifs. Comme modèle neurodégénératif, nous avons choisi des souris transgéniques (SCA1-Tg) d'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) qui expriment ATXN1 anormalement développé, spécifiquement dans les PC cérébelleux sous le contrôle du promoteur L7 spécifique de PC (également connu sous le nom de lignée B05)38 ,39. Des souris SCA1-Tg symptomatiques âgées de vingt-quatre semaines et leurs compagnons de portée de type sauvage ont reçu des injections cérébelleuses d'une dose plus faible d'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1,0 × 1010 vg /souris ; figure 5a).

une construction AAV (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) et schéma de l'injection de virus. AAV (dose : 1,0 × 1010 vg/souris) a été injecté dans le cervelet de souris de type sauvage et SCA1-Tg à l'âge de 24 semaines. Trois semaines après l'injection virale, des coupes cérébelleuses ont été analysées par immunohistochimie. b – d Image immunofluorescente GFP du cervelet de souris de type sauvage (WT). e–g Image immunofluorescente GFP d'une coupe sagittale du cervelet de la souris SCA1-Tg (B05). Les régions carrées de b et e ont été agrandies en c, d et f, g, respectivement. Barres d'échelle ; 500 μm (b, e) et 20 μm (c, d, f, g). Couche cellulaire granulaire GL, couche moléculaire ML.

Trois semaines après l'injection virale, des coupes cérébelleuses ont été immunomarquées pour GFP et Iba1. La microscopie confocale a révélé une transduction efficace et spécifique de la microglie dans des coupes de souris SCA1-Tg et de leurs compagnons de portée de type sauvage (Fig. 5b – g). Notamment, une population beaucoup plus élevée de microglie a été transduite dans le cervelet de la souris SCA1-Tg que dans la même portée de type sauvage, au moins en partie en raison de la densité significativement accrue de la microglie par rapport aux souris de type sauvage appariées selon l'âge. Ces résultats étendent l'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T pour cibler spécifiquement la microglie dans les tissus neurodégénératifs.

Pour examiner les changements morphologiques dynamiques dans la microglie, une imagerie confocale GFP vivante a été réalisée dans la couche de cellules granulaires de tranches cérébelleuses aiguës sept à 12 jours après l'injection d'AAV (AAV9-Iba1-GFP-miR-9.T-miR-129-2- 3p.T ; 3,9 × 1010 vg/souris) au cervelet. La plupart des cellules microgliales marquées au GFP présentaient une motilité morphologique basale, bien que le degré de motilité variait entre les cellules (Fig. 6a; Vidéos supplémentaires 1 à 3). Dans certaines cellules, l'application d'ATP dans le bain (100 μM) a induit une augmentation de la motilité avec un certain retard (Fig. 6b et vidéos supplémentaires 4 et 5). Ces résultats sont en accord avec la dynamique morphologique de la microglie41,42.

a, b Images fluorescentes Time-lapse GFP (temps indiqué au-dessus des images) montrant les mouvements basaux des processus microgliaux dans a et la régulation positive de la motilité induite par l'ATP de la microglie dans b (les cadres, lorsque 100 µM d'ATP ont été appliqués dans le bain, sont indiqués par ' + ATP ; 3 min d'application d'ATP dans le panneau supérieur et 1 min dans le panneau inférieur de b). Les panneaux supérieur et inférieur dans a et b correspondent à des exemples de différentes cellules. Barres d'échelle : 10 µm.

Ensuite, nous avons examiné si notre méthode d'expression génique sélective de la microglie pouvait être utilisée pour mesurer le signal Ca2 + à partir d'un indicateur de calcium fluorescent codé génétiquement, G-CaMP7.0943. Au moins une semaine après l'injection d'AAV (AAV9-Iba1-G-CaMP7.09-miR-9.T-miR-129-2-3p.T ; 3,9 × 1010 vg/souris) dans le cervelet, l'imagerie confocale en direct du Ca2+ a été effectuée dans la couche de cellules granuleuses de tranches cérébelleuses aiguës. Certaines microglies ont montré une activité Ca2+ spontanée (Vidéos supplémentaires 6 à 8 ; avant l'application d'ATP et Fig. 7b ; ROI 3 avant l'application d'ATP). L'application d'ATP (100 µM) dans un bain a induit de manière fiable une augmentation de Ca2+ non seulement dans des compartiments cellulaires plus grands (Fig. 7a, vraisemblablement des somas microgliaux ou des processus microgliaux plus grands ; Vidéos supplémentaires 7 et 8), mais aussi dans des compartiments plus petits (Fig. 7b, d, vraisemblablement processus fins microgliaux; Vidéo supplémentaire 7) de cellules G-CaMP-positives. L'amplitude maximale moyenne des changements de signal Ca2 + induits par l'ATP (∆F / Fbasal, voir méthodes) était de 3, 36 ± 0, 19 (Fig. 7c, n = 91 compartiments cellulaires de cinq tranches cérébelleuses de deux souris). Ces résultats correspondent à la dynamique typique du Ca2+ microglial, car la microglie exprime des récepteurs purinergiques et présente des réponses Ca2+ induites par l'ATP de l'ordre de quelques secondes35,44.

a, b Les panneaux de gauche montrent les images confocales moyennes des signaux G-CaMP exprimés viralement dans la couche de cellules granulaires des tranches cérébelleuses aiguës. Les régions d'intérêt (ROI 1 à 4) ont été définies sur des compartiments plus grands (éventuellement des somates microgliales ou leurs processus plus grands) dans a et sur des compartiments plus petits (éventuellement des processus microgliaux fins) de la microglie dans b. Les panneaux de droite montrent des traces de changements de signal Ca2+ estimés à partir de la fluorescence des ROI illustrés dans les panneaux de gauche. L'application de bain de 100 µM d'ATP (indiquée dans les barres noires) a évoqué les transitoires de Ca2+ de manière robuste dans les compartiments plus grands et plus petits de la microglie transduite. c Un graphique en boîte et moustache montrant les signaux quantifiés de Ca2+ induits par l'ATP appliqué dans le bain (∆F/Fbasal, voir méthodes) dans les compartiments cellulaires microgliaux. Les cercles vides indiquent des points de données individuels. La ligne horizontale et la boîte représentent respectivement la valeur médiane et l'intervalle interquartile. Les barres d'erreur indiquent un écart type au-dessus et au-dessous de la valeur moyenne (cercle plein). d Images fluorescentes accélérées montrant le mouvement d'un processus microglial exprimant G-CaMP7.09 (indiqué par un cercle blanc). Notez que les autres compartiments microgliaux G-CaMP-positifs en dehors du cercle blanc étaient statiques.

Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les protéines G-CaMP indicatrices de Ca2+ fonctionnelles sont exprimées avec succès dans la microglie cérébelleuse à l'aide de cette méthode. Ainsi, nous concluons que notre méthode d'expression génique spécifique de la microglie médiée par l'AAV est également applicable à l'expression d'un gène autre que la GFP, et que notre méthode peut être un outil puissant pour examiner la dynamique morphologique vivante dans la microglie.

Les microARN cellulaires, y compris miR-9 et miR-129-2-3p, jouent un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires telles que la survie cellulaire, la ramification dendritique et la plasticité synaptique45,46,47,48,49. Le piégeage des miARN endogènes par des séquences miR.T surexprimées dans les neurones et/ou d'autres types de cellules peut altérer les rôles inhérents des miARN et par conséquent perturber les fonctions cellulaires. Pour tester cette possibilité, l'ARNm contenant miR-9.T et miR-129-2-3p.T a été surexprimé dans tout le cerveau par l'application systémique de l'AAV-PHP.B pénétrant dans la barrière hémato-encéphalique exprimant GFP-miR- 9.T-miR-129-2-3p.T, utilisant le puissant promoteur hybride de cytomégalovirus et de β-actine de poulet (CBh)50 (AAV-PHP.B-CBh-GFP-miR.T) ou AAV-PHP.B exprimant GFP seule utilisant le même promoteur CBh (AAV-PHP.B-CBh-GFP; Fig. 9a supplémentaire). Étant donné que le cervelet exprime des niveaux plus élevés de miR-9 et miR-129-2-3p que d'autres régions du cerveau telles que le cortex cérébral, le tronc cérébral et la moelle épinière51, nous avons testé la capacité de coordination motrice associée au cervelet des souris traitées à l'aide de rotarod et tests de marche sur faisceau trois semaines après l'injection virale. Les résultats n'ont montré aucune différence statistiquement significative entre les deux groupes dans l'un ou l'autre des tests comportementaux (test t, n = 5 souris pour chaque groupe; Fig. 9b, c supplémentaires).

Après les tests comportementaux, les souris ont été sacrifiées pour analyse histologique. Les souris témoins ont montré une expression robuste de la GFP dans le foie et le cerveau (n = 5 souris, panneaux du milieu dans la Fig. 9d supplémentaire). En revanche, les souris exprimant GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T n'ont montré presque aucune expression de GFP dans le cerveau, malgré une forte expression de GFP dans le foie (n = 6 souris; panneaux inférieurs de la Fig. 9d). Des coupes sagittales du cerveau ont confirmé une suppression étendue de l'expression de la GFP dans tout le cerveau par la co-expression de miR-9.T-miR-129-2-3p.T (panneau supérieur droit de la Fig. 9e supplémentaire). Les images agrandies montrent une faible expression de GFP dans un petit nombre de cellules, y compris les cellules endothéliales vasculaires et les PC cérébelleux (panneaux du milieu et du bas à droite de la Fig. 9e supplémentaire).

Les miARN endogènes liés aux séquences cibles miR peuvent être dégradés avec les ARNm viraux. Pour examiner cela, nous avons comparé les niveaux de miR-9 endogène, miR-129-2-3p et miR-129-5p (comme contrôle) chez des souris exprimant GFP-miR-9.T-miR-129-2- 3p.T, et ceux exprimant la GFP seule dans trois tissus cérébraux (cortex cérébral, striatum et cervelet). Les résultats n'ont montré aucune différence statistiquement significative dans les niveaux de miR-9, miR-129-2-3p et miR-129-5p entre les deux groupes dans les trois régions du cerveau (test t, n = 5 souris par groupe, Fig supplémentaire .9f).

Pour vérifier l'influence de la surexpression de miR.T sur la fonction neurale, nous avons examiné les propriétés électrophysiologiques du cervelet chez des souris traitées à l'AAV-PHP.B exprimant la GFP seule ou en combinaison avec miR.T (miR-9.T et miR-129 -2-3p.T).

Les souris ont été tuées 3 semaines après l'injection virale. À fort grossissement de sections cérébelleuses de souris exprimant GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T, nous avons constaté que les PC étaient faiblement marqués avec GFP (panneau inférieur, Fig. 10a supplémentaire). Cela peut être dû au fait que l'expression de la cible GFP-miR induite par le promoteur CBh est suffisamment forte pour dépasser la capacité de silençage génique médié par miR. Dans cette étude, nous avons examiné électrophysiologiquement si les PC GFP-miR.T-positifs présentaient des anomalies fonctionnelles par rapport aux PC témoins exprimant GFP seul (sans miR.T) sous le contrôle du même promoteur (panneau supérieur, Fig. 10a supplémentaire).

Les propriétés de la membrane électrique passive des PC GFP-miR.T-positifs (PC GFP-miRs.T) étaient similaires à celles des PC GFP-positifs (PC GFP témoins ; Fig. 10b supplémentaire, à gauche, capacité membranaire, PC GFP témoins, 591,6 ± 45,1 pF, n = 18 PC GFP-miR.T, 655,6 ± 56,5 pF, n = 14, test t, P = 0,377 ; Fig. 10b supplémentaire, droite, résistance d'entrée, PC GFP de contrôle, 155,2 ± 38,6 MΩ, n = 18, PC GFP-miR.T, 139,7 ± 24,8 MΩ, n = 14, test t, P = 0,755). Nous avons examiné les schémas de déclenchement spontané des potentiels d'action (pointes) chez les PC par enregistrement de patch lâche extracellulaire (Fig. 10c supplémentaire, à gauche), et il n'y avait aucune différence dans les intervalles d'activités de pointe neuronale spontanée (c'est-à-dire le taux de déclenchement spontané) entre GFP- PC miR.T et PC GFP de contrôle (Fig. 10c supplémentaire à droite, PC GFP de contrôle, 43,1 ± 6,6 ms, n = 20 ; PC GFP-miR.T, 34,7 ± 5,8 ms, n = 15, test t, P = 0,369). Ces résultats suggèrent que l'expression excessive de miR.T n'a aucun effet sur les propriétés de déclenchement intrinsèques des PC cérébelleux.

Nous avons également examiné la transmission synaptique des fibres parallèles (PF) aux PC GFP-miR.T. Les réponses synaptiques excitatrices basales au niveau des synapses PF-PC ont été caractérisées en enregistrant les courants post-synaptiques excitateurs médiés par les récepteurs alpha-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-i (AMPA) en réponse à diverses intensités de stimulus appliquées au PF (Fig. 10d supplémentaire, à gauche). Il n'y avait pas de différence significative dans la relation intensité du stimulus-amplitude EPSC entre les PC GFP-miR.T et les PC GFP témoins (Fig. 10d supplémentaire, à droite; plusieurs tests t corrigés avec la méthode de Holm-Sidak, P> 0, 89 à toutes les intensités). La plasticité synaptique à court terme au niveau des synapses PF-PC a été examinée à l'aide de protocoles de stimulation par impulsions appariées avec des intervalles variables (10 ms à 5 s) entre les première et deuxième impulsions (Fig. 10e supplémentaire, à gauche). L'amplitude du deuxième EPSC PF évoquée par une paire d'impulsions a été normalisée par rapport à celle du premier EPSC PF, et le rapport (c'est-à-dire le rapport d'impulsions appariées) a été tracé par rapport aux intervalles inter-stimulus (Fig. 10e supplémentaire, à droite). Les PC GFP-miR.T et les PC GFP témoins ont montré une facilitation synaptique similaire à des intervalles plus courts (Fig. 10e supplémentaire), ce qui est typique des synapses PF-PC52, et il n'y avait pas de différence statistique dans les rapports d'impulsions appariées entre GFP-miR . PC T et PC GFP de contrôle (ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, effet miR, P = 0,35). Ces résultats suggèrent que la surexpression de miR.T n'influence pas la transmission synaptique basale ou la plasticité synaptique à court terme au niveau des synapses PF-PC.

Ensuite, nous avons examiné si l'application systémique d'AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T réussissait à transduire la microglie dans le cerveau. Des souris de type sauvage (WT) et SCA1-Tg âgées de 36 semaines ont reçu une perfusion intraveineuse d'AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1,5 × 1012 vg/ souris) et ont été tués 3 semaines après l'injection pour l'immunohistochimie (Fig. 8a). La microscopie confocale a montré des points lacrymaux GFP dispersés dans tout le cerveau, y compris le cervelet et les noyaux pontiques (souris WT et SCA1-Tg, Fig. 8b et Fig. 11 supplémentaire).

Des souris SCA1-Tg âgées de 36 semaines ont reçu une perfusion intraveineuse d'AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (dose : 1,5 × 1012 vg/souris). Trois semaines après l'injection virale, des coupes de cerveau ont été réalisées et analysées par double immunomarquage pour GFP et Iba1. (bd) Images immunofluorescentes d'une coupe sagittale (lobules II et III) de la souris SCA1-Tg (b) et agrandissement des régions carrées (c, d). Notez l'agrégation de GFP dans la microglie dans le cervelet de souris SCA1-Tg. Barres d'échelle, 20 μm. GL ; couche de cellules granulaires, iv ; injection intraveineuse, ML ; couche moléculaire, SCA1-Tg ; ataxie spinocérébelleuse de type 1-transgénique.

À un grossissement plus élevé, nous avons constaté que les points lacrymaux de la GFP étaient situés dans la microglie immunomarquée par Iba1 (Fig. 8c, d et Fig. 11d, e, g, h). Nous avons émis l'hypothèse qu'il s'agissait du processus de dégradation lysosomale de la protéine GFP dans la microglie. Pour vérifier cela, des coupes cérébelleuses ont été immunomarquées pour la GFP, Iba1, l'ADN nucléaire (en utilisant la coloration de Hoechst) et la protéine membranaire associée au lysosomal 1 (LAMP1), une glycoprotéine située à travers les membranes lysosomales53. Comme supposé, les agrégats de GFP étaient précisément co-localisés avec l'immunoréactivité de LAMP1 (Fig. 12 supplémentaire), indiquant que des agrégats de GFP étaient présents dans les lysosomes microgliaux. Ces résultats suggèrent que l'administration intraveineuse d'AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T provoque l'expression de la GFP spécifiquement dans la microglie. Cependant, contrairement à l'injection directe de tissu cérébral, la GFP est classée dans une voie digestive lysosomale.

Nous avons réussi la transduction spécifique de la microglie dans des régions cérébrales distinctes de souris adultes par injection directe dans le parenchyme cérébral de vecteurs AAV portant le promoteur Iba1 de souris de 1,7 kb et deux séries de copies de séquences en tandem 4, chacune étant complémentaire de différents miARN, miR -9 et miR-129-2-3p.

La présence ou l'absence et le niveau d'expression génique endogène sont strictement régulés d'une manière dépendante du stade de développement et spécifique au type de cellule. En revanche, l'expression du transgène médiée par l'AAV à l'aide d'un promoteur spécifique au type de cellule est moins influencée par cette régulation biologique en raison de l'incorporation insuffisante de promoteur spécifique au type de cellule, qui ne s'étend qu'à une région limitée du génome, et d'une éventuelle application de surdosage, conduisant à l'expression transgénique ectopique. dans les types cellulaires involontaires. Dans ce contexte, l'injection d'une dose optimale d'AAV portant un promoteur à haute spécificité pour la microglie est cruciale pour le ciblage microglial. Dans nos conditions expérimentales (Fig. 1b, f), le présent promoteur Iba1 de souris de 1, 7 kb a fonctionné préférentiellement dans la microglie du striatum (~ 69%) et du cervelet (~ 86%), alors qu'il n'a montré presque aucune spécificité pour la microglie dans le cortex cérébral (~ 2%), quelle que soit l'application de la dose la plus faible (tableau 1 et figure supplémentaire 3), suggérant une hétérogénéité des tissus cérébraux et une spécificité régionale du promoteur Iba1 de 1, 7 kb. Un autre inconvénient de l'utilisation de vecteurs viraux est la capacité d'encapsidation limitée, notamment dans l'AAV ; la taille relativement longue du promoteur Iba1 (1,7 kb) limite la taille du transgène à un maximum d'environ 2 kb.

Bien que nous ayons profité du promoteur Iba1 pour l'expression du transgène ciblant la microglie, il convient de noter que le promoteur Iba1 est précisément un promoteur spécifique des cellules myéloïdes et fonctionne dans les macrophages résidents du SNC, y compris les macrophages méningés, périvasculaires et du plexus choroïde ; cellules dendritiques; et monocytes infiltrants dans des conditions pathologiques. Ainsi, une population subtile de cellules transduites avec l'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T peut inclure ces types de cellules.

Les microARN guident les protéines Argonaute (AGO) et forment le module de ciblage du complexe de silençage induit par les miARN (miRISC), qui provoque la répression traductionnelle et la dégradation des ARNm ciblés54. Il a été démontré que miR-9 et miR-129-2-3p étaient enrichis en cellules non microgliales, mais étaient spécifiquement diminués en microglie22. Ainsi, les ARNm portant les séquences cibles sont épongés par les miRISC contenant miR-9 ou miR-129-2-3p, conduisant à l'extinction sélective de l'expression du transgène dans les cellules non microgliales. Une préoccupation est la dégradation simultanée des miARN et leur déplétion dans les cellules non microgliales, y compris les neurones. Cependant, les niveaux endogènes de miR-9 et miR-129-2-3p dans les trois régions du cerveau n'ont pas été modifiés de manière significative, même après la surexpression de GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T en utilisant un fort et promoteur CBh omniprésent (Fig. 9f supplémentaire), bien que l'expression de la GFP ait été considérablement supprimée (Fig. 9d, e supplémentaire). Ce résultat est cohérent avec un rapport récent55 montrant que des cibles totalement complémentaires (comme dans notre cas présent) sont clivées lorsqu'elles sont liées par un AGO catalytique, tel que l'Ago2 de mammifère, mais l'appariement de l'ARNm cible avec l'AGO entraîne le déchargement du miARN d'AGO et recyclage des miARN. Conformément à cela, la capacité motrice et les analyses de patch-clamp du cervelet n'ont pas été significativement modifiées chez les souris exprimant GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T dans tout le cerveau (Figs. 9 et 10 supplémentaires) . Néanmoins, une altération de la fonction neuronale dans d'autres régions du cerveau et une association avec des défauts de comportement lors de la surexpression de miR-9.T et miR-129-2-3p.T ne peuvent être exclues.

Contrairement à miR-129-2-3p.T, l'ajout de miR-136-5p.T à AAV9.Iba1.miR-9.T n'a pas réussi à supprimer l'expression du transgène dans les cellules non microgliales, malgré l'expression de miR-136 -5p dans les neurones21. Une étude précédente a démontré que les cellules dendritiques immatures exprimant de faibles niveaux de miR-155 ne supprimaient pas l'expression d'un transgène portant miR-155T, alors que les cellules dendritiques matures qui régulaient à la hausse les niveaux de miR-155 induisaient une suppression frappante de la cible32, suggérant que la régulation négative de la cible se produit à un certain seuil d'expression des miARN. Cette notion est soutenue par un rapport récent qui a révélé que les niveaux d'expression de miR-136-5p dans le cortex cérébral étaient bien inférieurs à ceux de miR-129-2-3p (et miR-9)51. Ainsi, les niveaux d'expression de miR-136-5p dans les cellules non microgliales sont probablement inférieurs au seuil de dégradation de l'ARNm cible.

En plus de la microglie ramifiée dans les tissus sains, les vecteurs AAV ont transduit la microglie réactive dans le cerveau des souris traitées au LPS et SCA1-Tg. Cela pourrait être avantageux car notre méthode peut être appliquée à des expériences pathologiques et précliniques ciblant la neuroinflammation et la neurodégénérescence, comme décrit précédemment dans les modèles murins de la maladie de Parkinson56. De plus, l'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T pourrait être utilisé pour des études fonctionnelles de la microglie, comme le démontre la surveillance basée sur G-CaMP7.09 de la mobilisation intracellulaire du Ca2+ (Fig. 7).

L'application intraveineuse d'AAV-PHP.B ciblant la microglie a entraîné l'expression de la GFP spécifique de la microglie. Cependant, de manière inattendue, la GFP exprimée a été transférée vers la voie de dégradation lysosomale. Étant donné que la microglie joue un rôle dans la lutte contre les virus qui pénètrent de la circulation périphérique vers le cerveau, la capside de l'AAV peut subir certaines modifications, telles que l'ajout ou le clivage de la glycosylation, lorsqu'elle traverse la BHE pour sensibiliser la microglie résidente. Ce résultat est décevant pour nous mais pourrait être un succès partiel dans l'administration intraveineuse d'un produit transgénique spécifiquement à la microglie. De plus, l'exploration du mécanisme sous-jacent à l'activation microgliale par l'AAV croisé avec la BBB (mais pas par l'AAV directement injecté dans les tissus cérébraux) peut conduire à l'identification d'une interaction clé (ou molécule) qui sensibilise la microglie résidente, ce qui facilite probablement le développement d'un mutant. capside qui ne sensibilise pas la microglie.

Ensemble, nos résultats ont validé l'efficacité de l'injection cérébrale directe d'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T pour la transduction de la microglie réactive dans un environnement pathologique ainsi que de la microglie ramifiée dans des cerveaux sains. . Bien que la microglie ciblant le cortex cérébral nécessite un ajustement minutieux de la dose d'administration et de la période d'incubation, l'AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T serait utile pour la recherche fondamentale et les études précliniques et pourrait également être prometteur dans les études cliniques ciblant la microglie, puisque les séquences de miR-9 et miR-129-2-3p sont largement partagées des rongeurs aux primates, y compris Homo sapiens.

Au cours de la préparation de ce manuscrit, des variantes de capside d'AAV à haute affinité pour la microglie ont été signalées ; cependant, ils n'étaient pas spécifiques à la microglie57. La combinaison de ces capsides mutantes à tropisme microglial avec notre Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T ciblant la microglie peut aider à réduire considérablement la dose d'application et à atteindre un ciblage microglial plus élevé dans le cortex cérébral.

Les séquences cibles ont été conçues sur la base des séquences de miARN obtenues auprès du miRNA Registry (www.mirbase.org). Les oligonucléotides utilisés pour la construction des miR.T sont présentés dans le tableau supplémentaire 1. Pour le vecteur PGK.miR-9.T, le sens 1 (S1), le sens 2 (S2), l'antisens 1 (AS1) et l'antisens 2 ( Les oligonucléotides AS2) ont été annelés et ligaturés dans les sites de restriction KpnI et BamHI dans le 3'-UTR de la cassette d'expression transgénique du vecteur AAV.PGK parent. Pour les vecteurs PGK.miR-9.T.miR-129-2-3p.T ou PGK.miR-9.T.miR-136-5p.T et S1, S2, S3, S4, AS1, AS2, AS3 , et les oligonucléotides AS4 ont été annelés et ligaturés dans les sites de restriction KpnI et BamHI dans le 3'-UTR de la cassette d'expression GFP du vecteur AAV.PGK parent.

Nous avons utilisé un fragment de 1 678 pb de la région flanquante en 5' du premier ATG dans l'exon 1 du gène Iba1 (Aif1) de souris. Pour cloner le promoteur Iba1, une PCR nichée a été réalisée en utilisant l'ADN génomique dérivé de cellules cérébrales de souris. Les ensembles d'amorces Iba1-Nest-F (5′-CCTAGAGCCATCTTGTAAGG-3′) et Iba1-Nest-R (5′-CGAGGAATTGCTGTTGAG-3′) ont été utilisés pour la première amplification de l'ADN et Iba1-F (5′-ATGCTCTAGActcgagTACTATAGGATGCATCGGTGAAAACC- 3′) et Iba1-R (5′-CATGGTGCGaccggtGGCTCCTCAGACGCTGGTTG-3′) pour le second.

Pour la construction de Iba1, Iba1.miR-9.T, Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (Addgene ID : 190163) ou Iba1.miR-9.T.miR-136 -5p.T, le promoteur PGK dans les vecteurs parents AAV.PGK correspondants a été remplacé par le promoteur Ibal de 1,7 kb de souris aux sites de restriction Xhol et AgeI.

Les vecteurs AAV2/9 et AAV-PHP.B ont été produits par co-transfection de cellules HEK293T (HCL4517 ; Thermo Fisher Scientific, Tokyo, Japon) avec trois plasmides : le plasmide d'expression, pHelper (Stratagene, La Jolla, CA, USA), et pAAV9. Les particules virales ont été purifiées en utilisant une précipitation au sulfate d'ammonium ou au polyéthylène glycol 8000 et une centrifugation en gradient continu d'iodixanol comme décrit précédemment58. Les titres génomiques des vecteurs AAV purifiés ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel à l'aide de Power SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) avec les amorces 5'-CTTGTTGGGCACTGACAATTC-3' et 5'-GAAGGGACGTAGCAGAAGGA-3' ciblant la séquence WPRE. Des vecteurs plasmidiques d'expression ont été utilisés comme étalons. Le titre d'expression du vecteur concentré variait de 6,92 × 1012 à 6,30 × 1013 vg/mL.

Des souris C57BL/6J (âgées de 4 à 8 semaines), des souris FVB/N-Tg (Pcp2-ATXN1*82Q) 5Horr et leurs congénères de type sauvage (âgées de 24 à 36 semaines) ont été utilisées dans cette étude. Dans toutes les expériences, une attention particulière a été accordée au sexe des souris pour éviter les biais envers les mâles ou les femelles. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par la loi japonaise sur le bien-être et la gestion des animaux et les directives pour la bonne conduite des expérimentations animales, telles que publiées par le Conseil scientifique du Japon. Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel de l'Université de Gunma (n° 21-063 et 21-065). Tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances et réduire le nombre d'animaux utilisés.

Des injections stéréotaxiques de vecteurs AAV ont été réalisées sur des souris C57BL/6J âgées de 4 semaines, des souris FVB/N-Tg symptomatiques âgées de 24 semaines et leurs congénères de type sauvage. Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel [PC]) et de xylazine (10 mg/kg de PC), respectivement. La profondeur de l'anesthésie a été surveillée à l'aide du réflexe de pincement des orteils tout au long de la chirurgie, et de la kétamine et de la xylazine supplémentaires ont été injectées si nécessaire. Un trou de bavure a été créé au-dessus du site d'injection pour exposer le cerveau. Un vecteur AAV (AAV9.PGK.miR-9.T, AAV9.Iba1, AAV9.Iba1.miR-9.T, AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T ou AAV9 .Iba1.miR-9.T.miR-136-5p.T) a été injecté dans le cortex cérébral, le striatum et le cervelet de souris. Pour réduire le volume d'inoculation et augmenter la précision, une seringue Hamilton de 10 μL avec une aiguille de 33 G a été utilisée pour les injections. Les coordonnées stéréotaxiques suivantes ont été utilisées pour l'injection virale : cortex cérébral, AP -1,0 mm, ML +1,5 mm, DV +0,9 mm ; striatum, AP -1,0 mm, ML +1,75 mm, DV +2,75 mm ; cervelet, AP +6,5 mm, ML 0 mm, DV 2,0 mm (toutes les valeurs sont relatives au bregma). La quantité totale de solution d'AAV était la suivante : cortex cérébral, 1,95 × 109 vg/souris ; striatum, 3,9 × 109 vg/souris ; cervelet, 3,9 × 1010 vg/souris pour injection à haute dose ; cortex cérébral, 5,0 × 108 vg/souris ; cervelet, 1,0 × 1010 vg/souris pour une injection à faible dose. Les vitesses d'application étaient les suivantes : cortex cérébral, 10 nL/min ; striatum, 20 nL/min ; et cervelet, 200 nL/min.

L'injection intraveineuse d'AAV-PHP.B a été réalisée sur des souris FVB/N-Tg symptomatiques âgées de 36 semaines et leurs congénères de type sauvage. Après anesthésie profonde, 100 μL de solution AAV-PHP.B (1,5 × 1013 vg/mL) ont été injectés par voie intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire de souris à l'aide d'une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de calibre 30 (08277 ; Nipro, Osaka, Japon).

Les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PB 0, 1 M (pH 7, 4), le cerveau a été post-fixé pendant 6 à 8 h et transféré dans du PBS 1x. Les cerveaux ont été découpés en tranches coronales de 50 µm pour le cortex cérébral, le striatum et les tranches sagittales du cervelet à l'aide d'un microtome (VT1000S ou VT1200S ; Leica, Wetzlar, Allemagne). Les tranches ont été traitées avec une solution de blocage (5 % de sérum d'âne normal, 0,5 % de Triton X-100 et 0,05 % de NaN3 dans du PBS) pendant 1 h et incubées pendant une nuit à 4 °C avec les anticorps primaires résumés dans le tableau supplémentaire 2. Après lavage avec du PBS trois fois pendant 15 min chacune, les tranches ont été incubées de 2 h à une nuit à 4 ° C avec les anticorps secondaires résumés dans le tableau supplémentaire 2. Enfin, les tranches ont été rincées trois fois dans du PBS, incubées avec la coloration d'acide nucléique Hoechst 33342 (Invitrogen numéro de catalogue H1399), lavé dans ddH2O, monté dans ProLong Diamond/Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher) et conservé à 4 °C dans l'obscurité. L'immunofluorescence a été analysée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM 800 et du logiciel associé (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne).

La proportion de cellules myéloïdes cérébrales transduites avec des vecteurs AAV a été examinée par immunohistochimie. Les coupes de tissu de 50 μm d'épaisseur obtenues à partir du cortex cérébral, du striatum et du cervelet ont été immunocolorées pour GFP et Iba1. Trente sections optiques consécutives à des intervalles de 0,5 μm (25 513,67 μm2, profondeur totale de 15 μm) ont été capturées à l'aide d'un microscope Zeiss LSM 800 avec un objectif 40x/0,95 NA, et les images ont ensuite été traitées avec le logiciel Zeiss Zen pour créer une projection d'intensité maximale ( MIP). À partir de chaque tranche de cerveau, 32 images MIP ont été acquises sans chevauchement (total 816 386,42 μm2) et le nombre de cellules myéloïdes exprimant la GFP a été compté. Les cellules GFP-positives co-marquées avec Iba1 ont été considérées comme des cellules myéloïdes cérébrales. Trois tranches de cerveau par souris et 4 à 9 souris ont été analysées. Un minimum de 500 cellules a été compté.

L'imagerie confocale Ca2 + ou GFP de tranches cérébelleuses aiguës a été réalisée comme décrit précédemment 27, 39, avec quelques modifications. Des coupes parasagittales (200-250 µm d'épaisseur) de vermis cérébelleux ont été préparées à l'aide d'un vibroslicer (VT1200S ; Leica, Allemagne) et maintenues dans une solution (ACSF) contenant (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1, 0 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 et 20 d-glucose, et barboté avec 95 % d'O2 et 5 % de CO2 à température ambiante pendant plus d'une heure avant le début des enregistrements. Le traitement et l'analyse des images ont été effectués à l'aide d'Andor iQ2 (Andor), NIH ImageJ, Igor Pro8 (WaveMetrics) et de programmes personnalisés de NH.

G-CaMP7.09 est un indicateur de Ca2+ codé par un gène récemment développé qui augmente sa fluorescence lorsque la concentration intracellulaire de Ca2+ est élevée43. Pour enregistrer les signaux Ca2+ des cellules exprimant G-CaMP7.09, des images de fluorescence confocale ont été acquises toutes les 2 s (temps d'exposition de 200 à 300 ms, 512 × 512 pixels, pas de binning) avec un objectif à immersion dans l'eau ×40 (LUMPLFLN 40XW ; Olympus , Tokyo, Japon), une caméra CCD refroidie par eau (iXon3 DU-897E-CS0-#BV-500 ; Andor, Belfast, Irlande du Nord) et une unité confocale à disque rotatif à grande vitesse (CSU-X1 ; Yokogawa Electric , Tokyo, Japon) fixé à un microscope droit (BX51WI ; Olympus, Tokyo, Japon). Un faisceau lumineux de 488 nm provenant d'un module laser à diode (Stradus 488-50; VORTRAN, Sacramento, CA) a été utilisé pour l'excitation et la fluorescence émise a été collectée à travers un filtre passe-bande (500–550 nm). Au cours des enregistrements, des tranches de cervelet ont été perfusées avec une solution de bain ACSF à température ambiante.

Pour évoquer une augmentation de Ca2+ intracellulaire dans la microglie, 100 µM d'ATP dissous dans la solution de bain ACSF ont été appliqués de manière extracellulaire via un dispositif d'application de bain alimenté par gravité44.

Étant donné que les enregistrements continus uniques ont duré plus de 10 minutes, une dérive d'image (dérive de traduction) a parfois été observée. Dans ces cas, les images dérivées ont été corrigées à l'aide du plugin Image Stabilizer dans ImageJ (http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html). La fluorescence du G-CaMP au temps t (Ft) dans chaque pixel a été soustraite en arrière-plan, et l'augmentation relative de la fluorescence dépendante du Ca2+ a été mesurée en calculant ΔF/Fbasal, où Fbasal est la moyenne de l'intensité de fluorescence de base pendant les trames pré-stimulus (c'est-à-dire , trames avant application ATP), et ΔF = Ft−Fbasal. La fluorescence de fond a été obtenue à partir d'une région dépourvue de la structure cellulaire dans le même cadre. Les valeurs moyennes ΔF/Fbasal dans chaque région d'intérêt (ROI) ont été calculées pour chaque image. Les ROI ont été placés sur des structures cellulaires G-CaMP-positives. Nous n'avons pas pu déterminer si plusieurs ROI adjacentes dans une trame se trouvaient sur la même cellule ou sur d'autres cellules différentes ; ainsi, nous avons qualifié une seule ROI de compartiment cellulaire microglial. Habituellement, la couverture d'un territoire de processus microglial atteint quelques centaines de micromètres42, et les données d'imagerie Ca2+ dans cette étude ont été recueillies à partir de 12 champs de vision différents, distants de plus de 300 µm, dans cinq tranches de deux souris. Par conséquent, nous pouvons dire en toute sécurité que notre ensemble de données d'imagerie Ca2+ provenait de plus de 12 microglies. Pour quantifier les signaux Ca2+ induits par l'ATP dans les cellules positives au G-CaMP, l'amplitude maximale de ΔF/Fbasal a été mesurée dans une fenêtre temporelle de 120 s après le début de l'application d'ATP.

Pour enregistrer la dynamique morphologique en direct dans les cellules GFP-positives, des images de fluorescence confocales GFP ont été acquises toutes les 2 à 6 s (exposition de 200 à 250 ms, 512 × 512 pixels, pas de binning). Le rapport signal sur bruit des signaux GFP était beaucoup plus élevé que celui des signaux G-CaMP dans nos conditions expérimentales. La dérive d'image dans l'imagerie GFP a été corrigée de manière comparable à celle de l'imagerie Ca2+.

Pour examiner si le phénotype comportemental était affecté par la surexpression des séquences cibles de miARN, des souris C57BL/6J âgées de 6 à 7 semaines ont reçu une injection intraveineuse d'AAV-PHP.B.CBh-GFP (PHP.B.CBh-GFP), ou AAV-PHP.B.CBh-GFP-miR-9.T.miR-129-2-3p.T (PHP.B.CBh-GFP-miR.T), respectivement à un titre de 6 × 1011 vg. Trois semaines plus tard, les performances motrices ont été évaluées à l'aide du test du rotarod sur un tapis roulant (MK-610A/RKZ ; Muromachi Kikai, Tokyo, Japon). Les souris ont été soumises à trois essais à 30 minutes d'intervalle. La vitesse de rotation a été accélérée de 4 à 50 tr/min en 300 s, et le temps mis pour tomber de la tige a été mesuré. Après le test rotarod, les souris ont encore été testées en utilisant un test de marche sur faisceau. Après accoutumance, les souris ont été placées sur un bord d'une barre (600 mm de long et 11 mm de diamètre) et ont marché trois fois sur la barre. La performance des souris marchant sur le faisceau a été enregistrée à l'aide d'une caméra vidéo numérique (vitesse d'obturation : 1/500, 60 ips ; HC-VX985M ; Panasonic, Osaka, Japon) et le temps moyen pour les souris de marcher à travers un 600- faisceau de mm de long a été mesuré.

Pour mesurer le nombre de miARN endogènes, des souris C57BL/6J âgées de 8 semaines ont reçu une injection intraveineuse de PHP.B.CBh-GFP ou de PHP.B.CBh-GFP-miR. T, à un titre de 6 × 1011 vg/souris. Trois semaines après l'injection, les souris ont été profondément anesthésiées et perfusées avec du PBS froid (-). Les cerveaux ont ensuite été rapidement extraits et divisés en deux parties, avec l'axe gauche-droite le long de la ligne médiane. Les cerveaux gauches (pour l'observation histologique) ont été immergés dans du paraformaldéhyde froid à 4 % (PFA) pendant une nuit à 4 °C et remplacés par du PFA à 4 % avec 1 × PBS (-) le lendemain. Des coupes sagittales (50 µm d'épaisseur) ont ensuite été réalisées à l'aide d'un microtome VT1200S (Leica). Les tranches ont été immunocolorées par fluorescence avec des anticorps anti-GFP (04404-84; Nacalai Tesque) et anti-NeuN (MAB377; Merck) et montées à l'aide de ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific). Des photomicrographies de sections immunocolorées ont été obtenues à l'aide d'un microscope à fluorescence BZ-X800 (Keyence). La moitié droite du cerveau a été utilisée pour mesurer les niveaux de miARN. Les lobes pariétaux du cortex cérébral, du cervelet et du striatum ont été collectés et placés séparément à l'aide du réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific). Le tissu a été homogénéisé à l'aide de BioMasher II (320103; Nippi, Tokyo, Japon) et Power Masher II (891300; Nippi), et rapidement trempé avec de l'azote liquide. Les tissus ont été stockés à -80 ° C jusqu'à ce que l'ARN soit collecté. Le kit miRNeasy Mini (217004 ; QIAGEN, Hilden, Allemagne) a été utilisé pour collecter les ARN totaux contenant les miARN. L'ARN total a été soumis à une transcription inverse à l'aide du kit de transcription inverse TaqMan MicroRNA (4366596 ; Thermo Fisher Scientific) et d'amorces de transcription inverse spécifiques aux miARN (Assay ID : 000583 ; 4427975 ; Thermo Fisher Scientific). Les quantités de miR-9, miR-129-2-3p et miR-129-5p dans les échantillons de miARN rétrotranscrits ont été quantifiées à l'aide d'une sonde TaqMan (Assay ID : 000583 ; 4427975 ; Thermo Fisher Scientific) et TaqMan Fast Advanced Master Mix (4444556; Thermo Fisher Scientific) dans un thermocycleur pour PCR en temps réel (Thermal Cycler Dice Real-Time System II, Takara Bio, Kusatsu, Japon).

Des tranches cérébelleuses aiguës ont été préparées et maintenues comme décrit dans la section Méthodes sur « l'imagerie confocale en direct » ci-dessous. Des enregistrements patch-clamp de cellules entières ont été effectués à l'aide d'un amplificateur MultiClamp 700 B (Molecular Devices, États-Unis) en mode voltage-clamp (potentiel de maintien de -70 mV) à température ambiante à partir des somates de PC cérébelleux à l'aide de pipettes patch (1–4 MΩ) tiré du verre borosilicaté (Harvard Apparatus) ou du verre #0010 (PG10165-4, World Precision Instruments). La solution de pipette contenait (135 mM) 135 K-gluconate, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 0,1 mM EGTA et 5 mM phosphocréatine (pH 7,3). Le potentiel de jonction liquide n'est pas corrigé. Les propriétés de membrane électrique passive des PC enregistrés ont été estimées à l'aide des traces moyennes de 20 réponses de courant évoquées par des impulsions de tension hyperpolarisantes (de -70 à -75 mV, durée de 500 ms) en mode voltage-clamp. Pour enregistrer les EPSC évoqués par des fibres parallèles (PF), la solution extracellulaire ACSF (voir la section "Imagerie confocale en direct" ci-dessous) a été complétée par de la picrotoxine (100 µM) pour bloquer les courants synaptiques inhibiteurs médiés par les récepteurs GABAA, et les PF ont été stimulés en appliquant carré impulsions (60 µs, 10–60 µA) à travers une pipette en verre remplie de la solution extracellulaire et placée dans la couche moléculaire de la tranche cérébelleuse. Pour l'enregistrement de patch lâche extracellulaire, les pipettes de patch ont été remplies de solution extracellulaire et placées à proximité des somatas des PC GFP-positifs (cellules lâches attachées). Les courants d'action spontanés (générés par décharge neuronale spontanée) ont été enregistrés à l'aide d'un amplificateur EPC-8 (HEKA Elektronik GmbH, Allemagne) pendant au moins 1 min à un potentiel de pipette de 0 mV. L'apparition de pointes a été détectée à l'aide d'un seuillage au niveau du courant. Lorsque les formes d'onde des courants d'action détectés n'étaient pas uniformes, les données étaient rejetées. Les intervalles entre les pics de tous les événements détectés ont été mesurés dans chaque PC, et une moyenne des intervalles a été prise comme valeur représentative de chaque PC enregistré. Toutes les données électrophysiologiques ont été acquises à l'aide du logiciel pCLAMP10 (Molecular Devices) et analysées à l'aide d'Igor Pro 8 (Wavemetrics) avec Neuromatic (http://www.neuromatic.thinkrandom.com/)59 et des procédures Igor personnalisées par NH.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corp., Armonk, NY) et GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Toutes les données ont été vérifiées pour la conformité avec les hypothèses statistiques pour chaque test, y compris la distribution normale et les variances égales entre les groupes. Sauf indication contraire, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM et des tests t bilatéraux non appariés ou des tests de comparaison multiple ANOVA ont été utilisés pour évaluer la signification statistique. Les données quantitatives de la spécificité microgliale dans le cervelet une semaine après l'injection virale ont été analysées par un test de Kruskal-Wallis non paramétrique car la normalité des données n'a pas été confirmée, et un test de Dunn post hoc avec ajustement de Bonferroni pour des comparaisons multiples a été utilisé pour déterminer la signification statistique (Tableau 1 ). Les données électrophysiologiques de l'amplitude PF EPSC et du rapport d'impulsions appariées ont été analysées à l'aide de plusieurs tests t corrigés avec la méthode de Holm-Sidak et l'ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, respectivement (Fig. 10d, e supplémentaire). La signification statistique a été considérée à P < 0,05 (ou l'équivalent corrigé pour les comparaisons multiples). Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, mais nos tailles d'échantillon étaient similaires à celles rapportées dans les études précédentes. Dans les graphiques pour les expériences électrophysiologiques, les graphiques à barres représentant les valeurs moyennes et les points de données individuels sont affichés en parallèle. Dans les boîtes à moustaches, les traits d'axe, les liens de boîte et les moustaches représentent respectivement la médiane, les 25e/75e centiles et les valeurs minimales/maximales. De plus amples détails sur l'analyse statistique sont rapportés dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Le plasmide contenant le promoteur Iba1 et deux types de miR.T utilisés dans cette étude sont disponibles auprès d'Addgene (Addgene ID : 190163). Les changements morphologiques microgliaux associés à cette étude sont présents dans l'article et les films supplémentaires. Les données sources pour chaque graphique associé sont fournies dans le fichier de données supplémentaires 1. Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant HH sur demande raisonnable.

Tous les codes d'analyse écrits sur mesure sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande.

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Les auteurs remercient Asako Ohnishi, Nobue McCullough et Ayako Sugimoto pour la production des vecteurs AAV, Junko Sugiyama pour élever les souris et Junko Sugi pour certaines expériences sur les souris. Cette recherche a été partiellement financée par le programme Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) sous les numéros de subvention JP19dm0207057, JP20dm0207057, JP21dm0207111 et JSPS KAKENHI (numéros de subvention 15H04254 , 16K15477, 18H02521, 15K18330, 19K06899 et 22K06454).

Département de neurophysiologie et de réparation neurale, École supérieure de médecine de l'Université de Gunma, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japon

Yukihiro Okada, Nobutake Hosoi, Yasunori Matsuzaki, Yuuki Fukai, Akito Hiraga, Keisuke Nitta, Yoichiro Shinohara, Ayumu Konno et Hirokazu Hirai

Division de physiologie buccale, Dentisterie de gestion des maladies, École supérieure de médecine dentaire de l'Université de Tohoku, Sendai, 980-8575, Japon

Junichi Nakai

Viral Vector Core, Université de Gunma, Initiative pour la recherche avancée, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japon

Ayumu Konno et Hirokazu Hirai

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YO, AK et HH ont conçu les expériences ; YO, KN, YS, YM, YF, AH, NH et AK ont effectué la recherche ; NH a mené les expériences d'imagerie Ca2+ ; JN a fourni le matériel expérimental ; YO a rédigé et HH a terminé l'étude.

Correspondance à Hirokazu Hirai.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Guochun Jiang, Negin Martin et Sandra Siegert pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Éditrices principales de la manipulation : Eliana Scemes, Véronique van den Berghe et Christina Karlsson Rosenthal. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Okada, Y., Hosoi, N., Matsuzaki, Y. et al. Développement de vecteurs viraux adéno-associés ciblant la microglie comme outils pour étudier le comportement microglial in vivo. Commun Biol 5, 1224 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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Reçu : 04 juillet 2022

Accepté : 31 octobre 2022

Publié: 11 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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