Un nouveau polypeptide

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 6624 (2022) Citer cet article

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Les nanoclusters d'or fluorescents fonctionnalisés par des biomolécules (AuNC) ont attiré beaucoup d'attention en raison de leur bonne biocompatibilité, de leurs propriétés physicochimiques stables et de leurs avantages considérables en termes de coûts. Une concentration inappropriée de Cu2+ peut provoquer diverses maladies. Dans cette étude, les AuNC ont été synthétisés dans une solution aqueuse alcaline en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme matrice. Et puis, le peptide CCYWDAHRDY a été couplé aux AuNCs. De plus, la fluorescence de la réponse synthétisée des CCYWDAHRDY-AuNCs au Cu2+ a été évaluée. Comme les résultats ont montré que les CCYWDAHRDY-AuNC peuvent détecter avec sensibilité Cu2+. Après avoir ajouté Cu2 + au système de sonde, la fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC a été désactivée. Les conditions de détection étaient à pH 6 et 30 °C pendant 10 min, la relation linéaire entre la concentration de Cu2+ et l'intensité de fluorescence était bonne dans la plage de 0,1 ~ 4,2 μmol/L. L'équation de régression était y = − 105,9x + 693,68, le coefficient de corrélation linéaire est de 0,997 et la limite de détection minimale était de 52 nmol/L.

L'accumulation d'ions de métaux lourds dans le système environnemental augmente le risque d'atteinte à l'environnement et à la santé humaine1,2,3,4,5. Les ions de métaux lourds peuvent facilement interférer avec les enzymes et les acides nucléiques et modifier les activités biologiques des organismes6. Cu2+ joue un rôle important en biologie en tant que métal de transition, et un apport adéquat de Cu2+ est nécessaire pour maintenir la santé de l'organisme7,8. Cependant, une concentration inappropriée de Cu2+ peut provoquer diverses maladies. Par exemple, l'anémie et la diminution de la vision sont des symptômes causés par le manque de Cu2+, et une teneur excessive en Cu2+ peut accélérer la détérioration de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Parkinson9,10,11,12,13. Cu2 + sont largement distribués dans le sol et l'eau, qui pénètrent facilement dans le corps humain par la chaîne alimentaire. La surveillance en temps réel de Cu2+ est une condition préalable à la sécurité alimentaire et à la prévention des maladies14,15. La spectroscopie de fluorescence, la colorimétrie, l'analyse électrochimique et la chromatographie en phase gazeuse ont été appliquées à la détection de Cu2+16,17,18,19,20. La technologie d'analyse de fluorescence a attiré une large attention en raison de sa sensibilité élevée, de son fonctionnement facile et de sa vitesse de détection rapide. Avec le développement des nanomatériaux et des sondes fluorescentes, les nanocluster d'or (AuNCs) en tant que capteurs fluorescents pour détecter les polluants dans l'environnement et les aliments, ont attiré l'attention de nombreux chercheurs21,22.

Les AuNC sont composées de dizaines voire de centaines d'atomes d'or, avec une taille moyenne de particule inférieure à 2 nm23,24. Par rapport aux colorants ou protéines fluorescents traditionnels, les AuNC ont d'excellentes propriétés telles qu'un faible effet sur l'activité des organismes, une stabilité élevée, une faible toxicité et une biocompatibilité élevée en raison de leur inertie chimique et de leur taille ultra-fine25. De plus, les AuNC ont un décalage de stokes plus important et une émission de fluorescence plus forte26. Avec l'ajout de cations métalliques multivalents, la liaison Au – S à la surface des AuNC est rompue en raison de l'interaction des groupes carboxyle et des ions métalliques, ce qui entraîne une extinction de la luminescence27,28.

Les propriétés de fluorescence des AuNC peuvent être ajustées en utilisant des ligands appropriés et des échafaudages biocompatibles29,30. Des études antérieures ont montré que les AuNC pouvaient être préparées à l'aide de protéines, d'acides aminés, de peptides, de thiols, d'acides nucléiques et d'autres biomolécules comme ligands, qui ont un degré élevé de biocompatibilité et peuvent être utilisés pour la détection sans interférence de matériaux biologiques31,32,33, 34. En particulier, les peptides sont souvent utilisés pour synthétiser des nanoclusters métalliques biocompatibles et fonctionnels en raison de leur structure tridimensionnelle spéciale, de leur séquence ajustable, de leur synthèse pratique et de leur prix économique33. Par exemple, Yuan et ses collègues ont comparé les NC Au25 protégées par l'acide nucléique peptidique à longue chaîne GSH avec des groupes -COOH et -NH2 riches en électrons produisant une luminescence plus forte35. La cystéine (C) a une bonne capacité de coordination36 et la tyrosine (Y) a une forte capacité à réduire les ions métalliques37, C et Y sont généralement introduits dans la séquence peptidique pour préparer les AuNC. Certains peptides peuvent être couplés aux AuNC pour détecter rapidement et efficacement les ions hautement toxiques. Par exemple, le capteur de bioluminescence CCYR6H4-AuNCs réduit la limite de détection et améliore la sélectivité au Hg2+ dans l'eau38.

Les sondes fluorescentes peuvent être appliquées au dosage de Cu2+ en raison du comportement d'extinction de fluorescence de Cu2+. Dans cette étude, les nouvelles sondes fluorescentes de CCYWDAHRDY-AuNC ont été synthétisées pour détecter le Cu2+ intracellulaire dans l'eau. Tout d'abord, la BSA a été utilisée comme agent réducteur et stabilisant pour préparer les AuNC, puis la solution CCYWDAHRDY et les AuNC ont été agitées et incubées à 25 ° C pendant 24 h pour obtenir les CCYWDAHRDY-AuNC. De plus, la spécificité des réponses CCYWDAHRDY-AuNCs au Cu2+ a été évaluée.

Tous les ions métalliques (c'est-à-dire Cu2+, Pb2+, Zn2+, Ni2+ et potassium) ont été achetés chez Sigma (St Louis, MO, USA). L'acide chloroaurique (AuCl3·HCl·4H2O), l'hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4) et le dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4) ont été obtenus auprès de Sinopharm Chemical Reagent Company (Shanghai, Chine). L'albumine de sérum bovin (BSA) a été achetée auprès de Changchun Dingguo Reagent Co., Ltd. (Jilin, Chine). Le peptide CCYWDAHRDY a été acheté auprès de GL Biochem (Shanghai) Ltd (Shanghai, Chine). Tous les produits chimiques étaient de qualité réactif analytique et utilisés directement sans autre purification. De l'eau distillée a été utilisée tout au long de l'expérience.

Toutes les verreries ont été nettoyées dans une solution d'eau régale fraîchement préparée (rapport volumique HCl: HNO3 = 3: 1) et soigneusement rincées dans de l'eau distillée avant utilisation. Tout d'abord, 5 mL de solution aqueuse de 10 mmol/L HAuCl4 et 5 mL de solution de BSA 50 mg/mL ont été mélangés sous agitation à 37 ℃ pendant 5 min. Ensuite, 1 mL de NaOH 1 mol/L a été ajouté aux mélanges ci-dessus. Et le mélange a été agité à 37 ℃ pendant 24 h pour obtenir le produit brut AuNCs. De plus, le produit brut AuNCs a été dialysé dans de l'eau distillée pour éliminer l'excès de grosses particules afin d'obtenir des AuNCs.

Le peptide CCYWDAHRDY conçu dans notre étude a été synthétisé par la procédure en phase solide en utilisant les méthodes de synthèse des acides aminés protégés FMOC39. La synthèse de CCYWDAHRDY -AuNCs a été réalisée par la méthode décrite par notre étude précédente40. Tout d'abord, la poudre de CCYWDAHRDY a été dissoute dans de l'eau ultra pure pour obtenir une solution aqueuse de 1 mg/mL de CCYWDAHRDY. Deuxièmement, 0,5 ml de solution aqueuse de CCYWDAHRDY a été ajouté dans 2 ml de solution AuNCs. Le mélange ci-dessus a été agité à 25 ℃ pendant 24 h doucement pour obtenir la solution CCYWDAHRDY-AuNCs, qui a été stockée à 4 ℃ dans l'obscurité.

L'intensité de fluorescence des AuNC et des CCYWDAHRDY-AuNC a été mesurée à l'aide du spectrophotomètre à fluorescence RF5301 (Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd.). La forme et la taille des AuNC et des CCYWDAHRDY-AuNC ont été analysées à l'aide du microscope électronique à transmission FEI Titan ETEM G2 (Shanghai Zhengfei Electronic Technology Co. Ltd.). Et le spectre d'absorption ultraviolet a été mesuré à l'aide du spectrophotomètre UV-Visible UV1800 (Shanghai Precision Instrument Co. Ltd.).

Une solution CCYWDAHRDY-AuNCs de 0,1 ml et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,84 ml avec différentes valeurs de pH, c'est-à-dire que 4, 5, 6, 7 et 8 ont été mélangés, puis 0,06 ml de solution standard Cu2+ à 60 μmol/L ont été ajoutés . L'intensité de fluorescence du mélange a ensuite été mesurée. Dans le groupe témoin, la solution standard de Cu2+ a été remplacée par une solution de PBS, et l'intensité de fluorescence du mélange a ensuite été mesurée.

Une solution CCYWDAHRDY-AuNCs de 0,1 ml et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,84 ml ont été mélangées, puis 0,06 ml de solution standard Cu2+ à 60 μmol/L ont été ajoutés. Ensuite, l'intensité de fluorescence du mélange a ensuite été mesurée à différentes températures (c'est-à-dire 10, 20, 30, 40 et 50 ℃). Dans le groupe témoin, la solution standard de Cu2+ a été remplacée par une solution de PBS, et l'intensité de fluorescence du mélange a ensuite été mesurée.

La solution CCYWDAHRDY-AuNCs de 0,1 mL et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,84 mL ont été mélangées, puis 0,06 mL de solution standard Cu2+ à 60 μmol/L ont été ajoutés, puis l'intensité de fluorescence du mélange avec un temps de réaction différent (c'est-à-dire 0, 5, 10, 15, 20, 25 et 30 min) a ensuite été mesuré. Dans le groupe témoin, la solution standard de Cu2+ a été remplacée par une solution de PBS, et l'intensité de fluorescence du mélange a ensuite été mesurée.

Les CCYWDAHRDY-AuNC (100 μL) ont été mélangés avec 0,06 mL de différentes concentrations de Cu2+ (c.-à-d. 0,6, 1,2, 1,8, 2,4, 3,0, 3,6 et 4,2 μmol/L) dans du tampon PBS (pH = 6), le volume final de le système réactionnel est de 1 mL. Le mélange a été incubé à 30°C pendant 10 min. Ensuite, un balayage spectral a été effectué et enregistré sur un spectrophotomètre à fluorescence. La courbe de détection de la concentration de Cu2+ a été établie en utilisant l'efficacité de fluorescence (F0/F) comme ordonnée. F0 et F indiquent respectivement l'intensité de fluorescence maximale du système de solution en l'absence et en présence de Cu2+. L'intensité de fluorescence des AuNC avec Cu2+ a également été enregistrée.

Les intensités de fluorescence de la solution d'essai contenant du Cu2+ avec différentes concentrations d'interférences ont été mesurées. Les ions métalliques suivants ont été utilisés : Co2+, Fe3+, Ni2+, Zn2+, Ca2+, K+, Na+, Pb2+.

Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SD (n = 3) et les différences ont été réalisées au moyen d'un test ANOVA à un facteur suivi d'un test de moindre différence significative (LSD) à l'aide de SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

La BSA a été utilisée comme agent réducteur pour la réaction de synthèse et agent protecteur pour le cluster. Comme le montre la figure 1 (a), la courbe ne présentait pas le pic d'absorption caractéristique autour de 520 nm des AuNC, il n'y avait donc pas de nanocristaux produits lors de la synthèse des AuNC, ce qui indiquait que les AuNC avaient une petite taille de particule et bien Dispersé. Comme le montre la figure 1 (b), les AuNC synthétisés étaient brun clair / jaune sous la lumière visible et émettaient une fluorescence orange intense sous l'éclairage d'une lampe UV à 350 nm. la taille moyenne des particules des AuNC était d'environ 1,8 nm avec une bonne dispersion et aucune agglomération de particules [illustré à la Fig. 1(c)], ce qui était cohérent avec les rapports précédents41,42.

Caractérisation des AuNCs : (a) Spectre d'absorption UV-visible des AuNCs, (b) Les photographies des AuNCs (La photographie de gauche est à la lumière du jour, La photographie de droite montre une lampe UV de 350 nm), (c ) La photographie TEM des AuNC, (d) Spectres d'émission de fluorescence des AuNC à une longueur d'onde d'excitation de 260 nm.

Comme le montre la figure 1 (d), la longueur d'onde d'émission maximale des AuNC était de 650 nm. Les AuNC modifiés par BSA avaient des nanostructures cœur-coquille Au0-Au1 et la fluorescence produite était le transfert de charge entre les ligands fluorescents et Au +. Le résidu tyrosine dans la BSA avait la capacité de réduire Au+ en Au dans des conditions alcalines. Dans le même temps, le résidu de cystéine dans la BSA pouvait capturer les AuNC dans le système via la liaison Au – S, et la BSA augmentait la stabilité du système de réaction.

La figure 2 (a) a montré que la dispersibilité du système était inchangée lorsque le CCYWDAHRDY était couplé aux AuNC. Il n'y a pas eu de changement évident dans la taille des particules et aucune agrégation ne s'est produite, ce qui suggère que le système aura une forte émission de fluorescence et des propriétés stables. Les spectres d'absorption UV-vis ont été utilisés pour étudier la caractérisation optique et la structure des AuNC et CCYWDAHRDY-AuNC. Comme le montre la figure 2 (b), les spectres des AuNC sont restés inchangés après le couplage avec le CCYWDAHRDY. Le CCYWDAHRDY utilisé dans nos expériences a modifié avec succès les AuNC sans affecter les propriétés des AuNC38. Il a été observé à partir de la Fig. 3 (a) que les AuNC couplés au CCYWDAHRDY étaient légèrement plus sombres que les AuNC sous la lumière naturelle, alors que l'émission de fluorescence orange-rouge des CCYWDAHRDY -AuNC sous la lumière ultraviolette était principalement similaire à celle des AuNC. .

Caractérisation des CCYWDAHRDY-AuNC : (a) photographie TEM des CCYWDAHRDY-AuNC, (b) spectre d'absorption UV-visible des AuNC et des CCYWDAHRDY-AuNC.

L'intensité de fluorescence des AuNCs et CCYWDAHRDY-AuNCs : (a) Photographies des AuNCs (1) et des CCYWDAHRDY-AuNCs (2) à la lumière du jour (à gauche) et sous une lampe UV de 350 nm (à droite), (b) Spectres d'émission de fluorescence des AuNC et des CCYWDAHRDY-AuNC à une longueur d'onde d'excitation de 260 nm.

La fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC a été comparée à celle des AuNC. Comme le montre la figure 3 (b), la fluorescence des AuNC a augmenté de manière significative après le couplage du CCYWDAHRDY. CCYWDAHRDY contenait peut-être une chaîne tripeptidique fonctionnelle CCY, où le groupe phénolique de la tyrosine pouvait réduire les ions d'or trivalents en atomes d'or, et la cystéine pouvait capturer les AuNC afin que le CCYWDAHRDY puisse se lier aux AuNC. De plus, l'atome d'oxygène riche en électrons ou l'atome d'azote dans le CCYWDAHRDY et le groupe fonctionnel (groupe carboxyle et groupe amino) dans le ligand pourraient améliorer efficacement le transfert d'électrons, augmentant ainsi l'intensité de fluorescence des AuNC modifiés par le CCYWDAHRDY. Le tryptophane (W) dans CCYWDAHRDY avait une forte capacité réductrice, ce qui pouvait favoriser la formation d'AuNC et augmenter l'intensité de la fluorescence. Dans le même temps, le CCYWDAHRDY a agi comme un stabilisateur approprié et a protégé davantage la fluorescence des AuNC, évitant ainsi l'agglomération des AuNC en particules plus grosses induites par des facteurs environnementaux externes et amélioré la stabilité de la fluorescence des AuNC.

Afin de sélectionner les meilleures conditions expérimentales, les principaux facteurs sont le pH, la température et le temps de réaction. Nous avons utilisé une longueur d'onde d'excitation de 650 nm et une solution standard de 60 μmol/L Cu2+ pour détecter la meilleure condition de réaction. Les effets des différentes valeurs de pH sur la réponse de fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC ont été étudiés et le pH du système expérimental a été optimisé, comme le montre la figure 4 (a). Lorsque le pH du système était de 6, le rapport d'intensité de fluorescence F0/F était le plus élevé. Lorsque le pH augmentait, F0/F se stabilisait et diminuait légèrement. Par conséquent, un tampon PBS à pH 6,0 a été choisi comme condition de détection optimale.

Influence de différents facteurs environnementaux sur l'effet de l'extinction de Cu2+ CCYWDAHRDY-AuNCs Fluorescence : (a) Intensité d'émission de fluorescence de CCYWDAHRDY-AuNCs à Cu2+ à différentes valeurs de pH, (b) Intensité d'émission de fluorescence de CCYWDAHRDY-AuNCs à Cu2+ à différentes températures, (c) Évolution de l'intensité de l'émission de fluorescence de CCYWDAHRDY-AuNCs vers Cu2+ au cours du temps.

La température a joué un rôle prédominant dans le système d'extinction de la fluorescence. L'effet de la température sur la détection a été étudié. Comme le montre la figure 4 (b), lorsque la température est passée de 10 à 30 ° C, le rapport d'intensité de fluorescence F0 / F a progressivement augmenté et le rapport d'intensité de fluorescence F0 / F a atteint un maximum à 30 ° C. Lorsque la température a continué à augmenter, le taux de trempe a progressivement diminué. Par conséquent, 30 ° C était la température de détection optimale.

L'extinction de la fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC par Cu2+ a été étudiée en fonction du temps de réaction (Fig. 4c). L'intensité de fluorescence de la réaction a diminué rapidement en 0 ~ 5 min. L'intensité de la fluorescence a diminué avec le temps. Après 10 min, la fluorescence est restée relativement stable et n'a pas diminué de manière significative. Par conséquent, 10 minutes ont été considérées comme le temps de réaction optimal.

Le couplage réussi de CCYWDAHRDY et AuNCs pourrait permettre une surveillance très sensible de Cu2+. La séquence tripeptidique DHA pourrait se chevaucher orbitalement avec Cu2+ à travers des atomes d'azote pour former une structure plane stable, qui pourrait permettre d'identifier Cu2+. Les CCYWDAHRDY-AuNC dans les conditions de réaction optimales ont été utilisés pour détecter quantitativement Cu2+. Comme le montre la figure 5, pour une plage de concentrations de Cu2+ comprises entre 0,1 et 4,2 μmol/L, l'intensité de fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC et F0/F diminue progressivement lorsque la concentration de Cu2+ ajoutée au système de fluorescence CCYWDAHRDY-AuNC augmente. Il existe une corrélation linéaire entre F0/F et les concentrations de Cu2+. L'équation de régression linéaire était y = − 105,9x + 693,68 avec un coefficient de corrélation de 0,997. La limite de détection minimale pour S/N = 3 était de 52 nmol/L. Comme le montre le tableau 1, par rapport aux études précédentes, la limite de détection du test pour Cu2+ détecté par CCYWDAHRDY-AuNC était inférieure. Elle est également inférieure à la concentration maximale admissible de Cu 2+ dans l'eau potable fixée par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) et l'Agence américaine de protection de l'environnement (EPA) (20 et 30 μmol/L, respectivement). Généralement, les CCYWDAHRDY-AuNC auront de larges perspectives d'application pour la détermination de Cu2+.

Réponse de fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC aux différentes concentrations de Cu2+.

Comme le montre la figure 6, la pente de la courbe de réponse des CCYWDAHRDY-AuNC à la concentration de Cu2+ était supérieure à celle des AuNC, ce qui indiquait que les CCYWDAHRDY-AuNC avaient une sensibilité plus élevée. La séquence tripeptidique DAH pourrait former une structure planaire stable avec le Cu2+. Par conséquent, dans l'ensemble du système de détection de fluorescence, les CCYWDAHRDY-AuNC peuvent reconnaître Cu2+ avec plus de sensibilité.

Réponse de fluorescence des AuNCs et CCYWDAHRDY-AuNCsand aux différentes concentrations de Cu2+.

Pour évaluer la sélectivité du système de détermination CCYWDAHRDY-AuNCs pour Cu2+, l'impact d'autres ions métalliques, c'est-à-dire Co2+, Fe3+, Ni2+, Zn2+, Ca2+, K+, Na+ et Pb2+ sur la réponse de fluorescence a été détecté. Comme le montre la figure 7, avec l'ajout d'autres ions métalliques, la fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC ne s'est pas éteinte de manière significative, même la concentration d'autres ions interférents était de 10 fois celle de Cu2+. Par conséquent, la méthode a une bonne sensibilité et sélectivité. Les CCYWDAHRDY-AuNC préparés ont une bonne fluorescence et une bonne stabilité, de sorte que la répétabilité des résultats du test pourrait être garantie.

Réponse de fluorescence des CCYWDAHRDY-AuNC lors de l'ajout de divers ions. La concentration de Cu2+ était de 60 μmol/L et la concentration des autres ions métalliques était de 600 μmol/L.

En résumé, la séquence CCYWDAHRDY a été conçue et CCYWDAHRDY-AuNCs a été synthétisé avec succès. Les conditions de synthèse optimales de pH étaient de 6,0, le temps de réaction était de 10 min et la température de calcination était de 30 °C. Les CCYWDAHRDY-AuNC ont montré une sélectivité élevée pour Cu2+, et la limite de détection minimale était de 52 nmol/L, l'intensité de fluorescence du Cu2+ et des CCYWDAHRDY-AuNC était linéaire dans la plage de 0,1 ~ 4,2 μmol/L. Par rapport aux AuNCs, la détection de Cu2+ par CCYWDAHRDY-AuNCs était plus sensible avec une spécificité élevée. Ces résultats indiquent que les CCYWDAHRDY-AuNC synthétisés pourraient être utilisés pour détecter le Cu2+.

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Collège des sciences et de l'ingénierie alimentaires, Université de Jilin, n ° 5333 Xi'an Road, Changchun, 130062, Chine

Hong Zhuang, Xinyu Jiang, Sijia Wu, Shujin Wang, Yong Pang, Yanjun Huang et Haiyang Yan

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Correspondance à Haiyang Yan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Zhuang, H., Jiang, X., Wu, S. et al. Un nouveau nanocluster d'or fluorescent modifié par un polypeptide pour la détection des ions cuivre. Sci Rep 12, 6624 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10500-9

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Reçu : 06 septembre 2021

Accepté : 04 avril 2022

Publié: 22 avril 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-10500-9

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