Albumine de sérum bovin

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12336 (2022) Citer cet article

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Le graphène et sa famille ont un grand potentiel en ingénierie tissulaire en raison de leurs propriétés super mécaniques, de leur conductivité électrique et de leurs propriétés antibactériennes. Compte tenu d'autres propriétés du graphène telles que la surface élevée et la fonctionnalisation prête à l'emploi selon les groupes à haute teneur en oxygène de la famille des oxydes de graphène, certains besoins pourraient être abordés dans l'ingénierie des tissus osseux. Ici, nous avons synthétisé et décoré des nanoparticules de strontium (SrNP) au cours du processus de réduction de l'oxyde de graphène en utilisant une méthode verte et nouvelle. Sans utiliser d'hydrazine ou de lieurs chimiques, les NP de strontium ont été synthétisés et décorés à la surface de rGO simultanément à l'aide de BSA. Les résultats de la spectroscopie UV-Vis, FTIR et Raman ont démontré que la BSA pouvait réduire avec succès l'oxyde de graphène et les SrNP décorés à la surface de rGO. FESEM et TEM ont montré que les SrNP synthétisés in situ avaient un diamètre de 25 à 30 nm. Fait intéressant, la viabilité cellulaire des cellules MC3T3-E1 traitées avec SrNPs-rGO était significativement plus élevée que celle de BSA-rGO et GO à concentration constante. De plus, nous avons étudié l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) de ces nanofeuilles dont les résultats ont démontré que Sr-BSA-rGO a amélioré l'activité ALP plus que GO et BSA-rGO. Remarquablement, l'expression relative des gènes RUNX 2 et Col1 des cellules MC3T3-E1 a été stimulée lorsqu'elles sont traitées avec des nanofeuillets Sr-BSA-rGO. Cette étude a révélé que l'utilisation de protéines et d'autres biomolécules comme agent vert et facile pour la décoration de nanoparticules intelligentes à la surface de nanofeuilles serait prometteuse et aiderait le chercheur à remplacer les matériaux durs et toxiques de type hydrazine par une méthode bio-compatible. Ces résultats ont démontré que Sr-BSA-rGO avait une excellente capacité de régénération du tissu osseux et pouvait être utilisé comme stimulant de l'ostéogenèse dans les implants.

L'os est l'un des tissus les plus critiques du corps, car il sert de base au soutien mécanique, à la protection des organes et à la continuité du squelette. Des dommages à l'intégrité structurelle osseuse peuvent survenir pour diverses causes, notamment un traumatisme, une intervention chirurgicale, des tumeurs et l'ostéoporose1. Dans la plupart des cas, l'os a une capacité importante à se régénérer et à se réparer. Cependant, il existe certaines situations dans lesquelles une régénération complète du tissu osseux n'est pas réalisable et nécessite une stimulation supplémentaire2. Les biomatériaux sont une alternative viable aux greffes osseuses dans l'ingénierie tissulaire osseuse3,4. L'hydroxylapatite synthétique, le phosphate tricalcique, d'autres biocéramiques, les échafaudages polymères et les implants métalliques sont des exemples de biomatériaux largement utilisés dans l'ingénierie des os et des tissus durs4. Les progrès de la nanotechnologie ont transformé la recherche nanomédicale en science clinique, aboutissant à de nouveaux nanodispositifs et nanosystèmes qui reposaient sur la conception et l'intégration parfaite de nanomatériaux fonctionnels. Les dérivés de la famille des graphènes ont suscité beaucoup d'intérêt dans les applications biomédicales parmi de nombreux nanobiomatériaux synthétiques5,6. Une version hydrophile de la feuille de graphène avec des atomes de carbone sp2 hybrides, connue sous le nom d'oxyde de graphène (GO), est apparue comme une application biomédicale prometteuse7. La forme réduite d'oxyde de graphène, qui présentait une toxicité, une biocompatibilité et des sites de réaction minimes, peut être utilisée pour stimuler les activités cellulaires et augmenter la capacité ostéogénique du tissu osseux8,9,10. Les propriétés thérapeutiques orthopédiques du strontium (Sr) ont suscité de l'intérêt dans ce contexte11. Les tissus durs humains peuvent accumuler du Sr qui peut déplacer le calcium de la phase apatite du minéral osseux. Le Sr est également associé à une augmentation de la résistance à la compression des os, alors que sa pénurie est associée à des conséquences négatives sur les tissus durs. Des études in vitro et in vivo ont démontré que les ions Sr stimulaient la formation osseuse et inhibaient la résorption osseuse, ce qui en faisait un agent potentiel pour le traitement de l'ostéoporose12. Les propriétés du Sr en ont fait un ingrédient populaire dans les verres bioactifs et les biocéramiques en raison de ses avantages13. Sr a été utilisé dans des applications de remodelage osseux en raison de sa similitude structurelle et physico-chimique avec les ions calcium (Ca2+). Par exemple, l'incorporation de Sr dans des implants en phosphate de calcium et en titane a été étudiée pour améliorer les propriétés de formation osseuse de ces matériaux14. En raison de la grande surface des nanofeuilles de graphène, des chercheurs ont récemment synthétisé des SrNP à la surface du graphène par co-réduction de GO et Sr15. L'hydrazine, en tant qu'agent réducteur, a été utilisée pour réduire et malgré les SrNP à la surface des rGO rapportés par Kumar et al.16. Récemment, Qi et al. nanofeuillets rGO décorés au Sr synthétisés à l'aide d'hydrazine incorporée dans le poly (L-lactide) (PLLA) pour la fabrication d'un échafaudage 3D. L'induction de l'ostéogenèse dans Sr-rGO a été dépassée par les échafaudages rGO et PLLA purs15. Cependant, ces études ont démontré la grande capacité des nanofeuilles de Sr-rGO pour l'ingénierie des tissus osseux, car l'amélioration de la résistance du graphène et des propriétés d'ostéogenèse du Sr en utilisant l'hydrazine dans le processus de synthèse présentait des préoccupations majeures. Premièrement, la solubilité dans l'eau des nanofeuilles de rGO a considérablement diminué, ce qui a causé des difficultés dans le processus de fabrication du composite à base de graphène. Deuxièmement, l'hydrazine était un réactif toxique qui a affecté la santé de l'utilisateur au cours de l'expérience17. De nombreux efforts ont été faits pour introduire un réducteur vert et sûr afin de surmonter cette limitation de l'hydrazine. Par exemple, des protéines telles que l'albumine sérique bovine (BSA) et l'acide ascorbique sont des réducteurs sûrs pour GO3,18,19.

Les protéines sont des biopolymères complexes avec des segments hydrophobes et hydrophiles, qui peuvent servir d'adhésif pour les surfaces solides20. La BSA est une protéine de forme sphérique qui possède 583 résidus d'acides aminés21. Dans la structure de la BSA, il y a des résidus de tyrosine qui la distinguent comme un agent réducteur distinct20. Les sections hydrophobes de la BSA peuvent être adsorbées sur une surface hydrophobe, tandis que les parties hydrophiles de la BSA pourraient interagir avec des groupes fonctionnels de l'eau en présence d'oxygène22.

Dans cette étude, des nanofeuillets de Sr décorés de graphène ont été synthétisés par co-réduction de GO et de nitrate de strontium en présence de BSA, nommé Sr-BSA-rGO. Le processus de synthèse est illustré à la Fig. 1. Dans Sr-BSA-rGO, les SrNP ont été localisés sur les surfaces des nanofeuilles rGO, et en étroite collaboration avec la BSA qui agit comme un obstacle stérique pour bloquer le réempilement des nanofeuilles rGO après réduction. Ensuite, la présence de SrNPs à la surface de rGO a été étudiée à l'aide de différentes méthodes. Dans ce qui suit, la lignée cellulaire d'ostéoblastes a été utilisée pour étudier l'effet de Sr décoré de BSA-rGO sur la prolifération. L'activité de la phosphatase alcaline (ALP), qui est un facteur important dans l'ingénierie du tissu osseux, a également été étudiée. Enfin, l'expression des gènes COL1 et RUNX2 a été révélée par PCR en temps réel.

Nanosheets Sr-BSA-rGO dans l'ingénierie des tissus osseux. Cette illustration montre le processus de synthèse et d'application du laboratoire de chimie au laboratoire de génétique moléculaire, qui a été utilisé dans cette étude.

Le graphite, le KMnO4, l'acide sulfurique (H2SO4) ont été achetés chez Merck. BSA, nitrate de strontium (SrNO3) ont été achetés chez Sigma. Tous les réactifs ont été utilisés sans purification.

Conformément à la technique modifiée de Hummer, la poudre d'oxyde de graphène a été produite par l'oxydation chimique du graphite noir en laboratoire. Dans cette méthode, 1 g de graphite a été exposé à 23,3 ml de H2SO4 dans un bain de glace, lequel graphite a été inséré entre le milieu acide. L'agent d'oxydation a remplacé l'insertion d'acide pour produire l'oxyde de graphite vierge. Afin de générer de l'oxyde de graphite pur (PGO), KMnO4 a été utilisé comme oxydant et a été ajouté progressivement de 5 à 15 °C23. Une purification des impuretés a été effectuée afin de convertir le graphite en oxyde de graphite (GO). L'hydrolyse du PGO a été utilisée pour éliminer le contaminant sulfate restant. Pour éliminer le sulfate covalent de PGO, 150 ml d'eau distillée ont été ajoutés et la température a été augmentée à 90 ° C dans les conditions d'agitation en 30 minutes, et le système a été dilué à nouveau via 500 ml d'eau distillée. Par exemple, du peroxyde d'hydrogène (H2O2) a été ajouté goutte à goutte instantanément, pour soustraire le KMnO4 n'ayant pas réagi qui a changé la couleur en brun foncé24. La solution d'oxyde de graphite a été filtrée et lavée avec du HCl dilué et de l'éthanol dans la centrifugeuse à 8 000 tr/min, et séchée à température ambiante. Un processus ultrasonique a été mené pour exfolier les nanofeuilles GO. La poudre d'oxyde de graphite a été dispersée dans l'eau déminéralisée (10 mg/ml), puis soniquée à une puissance de 30 W pendant 3 h (notez que la température de la solution doit être de 4 °C en utilisant un bain de glace).

Nous avons utilisé du BSA comme agent réducteur vert et une colle bio, pour lier le Sr à la surface GO. Initialement, 0,5 g de GO ont été dispersés dans de l'eau déionisée (200 ml) à l'aide d'ultrasons, pour exfolier la couche de GO dans l'eau. 2,5 g de BSA ont été ajoutés à la solution de GO exfoliée dans des conditions d'agitation. Pour faire une réaction entre BSA et GO, le pH de la solution a augmenté à 11,5 en ajoutant goutte à goutte du NaOH 1 M. Le mélange GO-BSA a été mélangé pendant 24 h et les impuretés solubles ont été séparées par centrifugation à l'éthanol. Pour la production de Sr-BSA-rGO, le nitrate de strontium a été combiné avec GO à différentes concentrations (5, 10, 20 % en poids de GO). Brièvement, BSA-rGO a été dispersé et soniqué dans de l'eau déminéralisée pendant 1 h (puissance : 30 W). Ensuite, du nitrate de strontium a été ajouté à la solution de rGO et agité pendant 2 h pour obtenir un mélange homogène. Le mélange a ensuite été lavé avec de l'éthanol.

Cette étude a utilisé une analyse par diffraction des rayons X sur les poudres produites à l'aide d'un diffractomètre PHILIPS-PW1730 avec rayonnement Cu-K, pour déterminer la phase et la cristallinité. Les caractéristiques microstructurales des nanofeuillets générés ont été étudiées à l'aide d'un microscope électronique à balayage à émission de champ (FESEM, Hitachi S-3400 N, tension de 20 kV) et d'un microscope électronique à transition (TEM, Philips, CM300). La spectroscopie Raman a été réalisée à l'aide de TakRam N1-541, Teksan Co, Iran. Les spectres FTIR ont été enregistrés à l'aide de TENSOR 27 Brucker.

Nous avons utilisé la lignée cellulaire MC3T3-E1 provenant de la National Cell Bank of Iran (NCBI) de l'Institut Pasteur d'Iran (IPI). On a laissé les cellules se développer dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) à pH neutre (7,2 à 7,4), complété par 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (50 °C, 30 min) (FBS, 10 % v/v), 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Ensuite, les cellules ont été trypsinisées (0,025 % de trypsine, 0,02 % d'EDTA) après avoir été cultivées jusqu'à 70 à 80 % de confluence. Avant les traitements, les cellules ont été laissées pendant une nuit se rattacher au fond d'une plaque de culture cellulaire à 96 puits.

L'effet des traitements Sr-BSA-rGO, BSA-rGO (appelé rGO dans les graphiques) et GO sur la viabilité des cellules MC3T3-E1 a été déterminé à l'aide du 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5 -dosage du bromure de diphényltétrazolium (MTT) à chaque temps de traitement souhaité. Des solutions de travail (1, 10, 50 et 100 μg/ml) de nanofeuillets Sr-BSA-rGO ont été préparées dans du milieu DMEM avec 1 mg/ml de solution mère (dispersée dans du milieu DMEM). Nous avons également utilisé une solution de nanofeuillets GO et BSA-rGO (concentration 100 μg/ml) pour étudier l'effet des nanoparticules de Sr. Après le traitement, les boîtes ont été incubées pendant 24, 72 et 120 h pour étudier l'effet de différents temps d'incubation sur la viabilité cellulaire. À chaque instant, 20 µl de solution de MTT (5 mg/ml) ont été ajoutés dans chaque puits de culture cellulaire (volume de milieu : 200 µl). La plaque a été incubée à 37°C pendant 4h. Après incubation, la solution précédente a été retirée lentement et suivie de 100 µl de solution DMSO ajoutés dans chaque puits. Les plaques de culture cellulaire ont été replacées dans l'incubateur pendant 1 h. L'absorbance a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaques BioTek.

L'ALP est l'un des facteurs les plus importants à mesurer dans l'ingénierie du tissu osseux. Après avoir mesuré la viabilité des cellules traitées par les nanofeuillets Sr-BSA-rGO, BSA-rGO et GO à différents temps d'incubation, nous avons sélectionné la concentration la plus élevée de Sr-BSA-rGO (100 μg/ml) et la concentration constante de BSA-rGO et Nanosheets GO (100 μg/ml) pour l'étude de l'activité ALP des cellules MC3T3-E1. Les cellules ont été cultivées sur des plaques à 6 puits (100 x 103 cellules par puits) et incubées pendant une nuit pour adhérer à la surface de la plaque. Dans ce qui suit, les milieux ont été remplacés par les solutions de travail de nanofeuilles et récoltés dans l'incubateur. Le kit ALP (Pars Azmun, Iran) a été utilisé pour l'expérience selon le protocole de fabrication. L'absorbance des puits a été enregistrée à l'aide d'un lecteur de plaque à 405 nm.

L'expression des gènes liés à l'ostéogenèse a été examinée pour étudier le potentiel de différenciation ostéogénique des cellules cultivées sur des échantillons traités au Sr-BSA-rGO. En bref, les cellules ont été récoltées à une densité de 104 cellules par puits dans une plaque à six puits et cultivées pendant la nuit. Suite à cela, les nanofeuilles Sr-BSA-rGO ont été mélangées dans des milieux de culture (100 μg/ml) et cultivées pendant 1, 3 et 5 jours, et les puits ont été considérés comme contrôle (sans nanofeuilles). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec une solution de PBS avant d'être digérées avec 0,25 % de trypsine. L'ARN cellulaire a été extrait avec le réactif RNX (Zist Idea) et transcrit en ADNc avec le kit de synthèse d'ADNc PrimeScript 1st strand (Iran). Enfin, les niveaux de Col1 et du facteur de transcription lié à l'avorton-2 (Runx2) ont été déterminés. Chaque groupe a été examiné trois fois. Les détails de la conception de l'amorce utilisée dans cette étude se trouvent dans le tableau 1.

Toutes les données ont été recueillies en trois exemplaires et les graphiques ont été générés à l'aide du logiciel Graphpad prism 8. L'Anova bidirectionnelle a été utilisée pour étudier la signification des différences entre les groupes.

La figure 2a montre les spectres UV-Vis de GO, BSA-rGO et BSA. GO, une forme passion des familles de graphènes, a montré un spectre UV-Vis unique. Dans ces spectres, les pics caractéristiques de GO étaient de 225 et 310 nm, attribués respectivement aux interactions π-π et n-π. Le processus d'exfoliation et d'oxydation du graphène produit a été confirmé par l'apparition de ces pics. Après réduction de GO avec BSA, le pic à 232 nm a été déplacé à 260 nm et l'intensité du pic à 310 nm a été significativement diminuée. En administrant les molécules de BSA dans le GO, ces pics se sont déplacés ou ont disparu en raison du processus de réduction. Nous avons constaté que la couleur brunâtre de GO était devenue noire après réduction et que la couleur noire était stable lorsque Sr était ajouté au mélange BSA-rGO (Fig. 2b, les images ont été enregistrées 1 semaine après la synthèse). Les modèles XRD de GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO sont visibles sur la figure 2c. Le modèle correspondant à GO montre un pic caractéristique à 2θ = 12,3° attribué à l'espacement (001). Selon l'équation de Scherrer et l'espacement d pour l'oxyde de graphène produit, la hauteur d'empilement et le nombre de couches sont respectivement de 8,9 nm et 8. En raison de la liaison amide de BSA, le pic large et plutôt fort positionné dans la plage de 20 à 27 ° a été détecté dans BSA-rGO. Pendant ce temps, en raison de la dispersion homogène de GO à l'intérieur de BSA, il n'y a pas de pic GO caractéristique dans les modèles XRD des composites BSA-rGO, ce qui implique un trouble à longue portée ou une exfoliation complète de GO dans le BSA-rGO, que le résultat est cohérent avec des recherches antérieures25. Dans le modèle XRD final, les pics caractéristiques des nanofeuilles métalliques de strontium et de rGO étaient observables. Les pics à 25,42° et 29,46° correspondaient aux plans cristallins [111] et [200] de la structure cubique compacte du strontium (JCPDS 89-4045), alors que les pics faibles et larges de BSA-rGO pouvaient être détectés à 20–27°. La réduction de l'intensité du pic de rGO montre que les SrNP métalliques accrochés à sa surface empêchaient les nanofeuilles de BSA-rGO de se réempiler, ce qui donnait des nanofeuilles de Sr-BSA-rGO mieux exfoliées que les nanofeuilles de BSA-rGO.

Caractérisation des nanofeuillets Sr-BSA-rGO. ( a ) Les spectres UV – Vis de BSA, GO et BSA-rGO dispersés dans de l'eau déionisée (concentration: 0, 1 mg / ml). ( b ) Images des GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO synthétisés. ( c ) et ( d ) Profils XRD et FTIR des nanofeuillets GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO respectivement.

Il a été démontré que la croissance de NP métalliques sur GO ou rGO provoque la disparition ou la diminution des pics graphitiques empilés, car les particules métalliques empêchent le réempilement. L'existence de SrNP métalliques cristallins sur la surface rGO bien exfoliée a été validée par des données XRD, qui ont indiqué la synthèse de GO et la réduction sérique de GO en rGO. Les spectres FTIR des GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO synthétisés ont été présentés sur la Fig. 2d. Les pics GO caractéristiques dans le spectre FTIR correspondent à 3386 cm−1, 1728 cm−1 et 1615 cm−1 avec les liaisons O–H, C=O et C=C, respectivement26. De plus, les pics à 1050 cm−1 et 1224 cm−1, se rapportent à la vibration d'étirement C–O, et aussi, le pic caractéristique de 1376 cm−1 appartient à la vibration de déformation de C–O27. Il y a eu plusieurs changements dans le modèle BSA-rGO par rapport au GO. Le pic à 630 cm-1, qui était spécifique à la vibration de mélange de O = C – NH, était lié à la liaison du BSA déposé sur le composé GO. Le nouveau pic est apparu à 2850 cm-1, était pour les vibrations d'étirement C–H du groupe fonctionnel méthylène BSA25. En résumé, pour les nanofeuillets GO et BSA-rGO, l'apparition de pics à 630 cm-1 et 2850 cm-1 dans les composés contenant du BSA, contrairement aux nanoparticules GO, a confirmé la formation du composite BSA-rGO. La diminution du Sr-BSA-rGO à 630 cm-1 et 2850 cm-1 a pu être mise en évidence et les SrNPs chargés positivement étaient fortement décorés à la surface des nanofeuillets de rGO. D'autre part, nous avons observé la réduction des groupements hydroxyles en introduisant du nitrate de strontium. Selon les rapports précédents, les groupes hydroxyle pourraient interagir avec les ions Sr2+ en raison de l'électronégativité et après décoration Sr, l'intensité des groupes hydroxyle dans les spectres FTIR serait réduite28.

La spectroscopie Raman est une technique utile pour caractériser les nanofeuilles à base de carbone, car elles fournissent des informations précieuses sur la structure cristalline des matériaux à base de graphène. Une variété de groupes d'oxygène issus de l'oxydation du graphite établissent une structure extrêmement irrégulière de GO. La figure 3a montre les spectres Raman des nanofeuillets GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO. Tous les modèles présentaient deux pics majeurs correspondant aux bandes D et G. La bande D révèle la présence de sites carbonés incomplets et désordonnés tandis que la bande G est associée à des atomes de carbone organisés29. Les bandes D et G (ID/IG) étaient les paramètres critiques pour déterminer la structure graphitique ordonnée et désordonnée27. Nous comprenons les transformations structurelles en raison de l'augmentation ou de la diminution du rapport d'intensité relatif (ID/IG). Le spectre Raman du BSA-rGO présentait deux pics à 1347 cm-1 et 1599 cm-1 liés respectivement aux bandes D et G. La bande G de BSA-rGO correspond à la restauration des défauts selon le réseau hexagonal d'atomes de carbone30. Le rapport ID/IG relatif était de 1,108, ce qui a confirmé le processus de réduction de la structure GO, créant une grande quantité de défauts de construction30. Après adsorption du strontium, la bande D est restée à 1347 cm-1 et la bande G est passée à 1594 cm-1. La légère croissance de l'intensité de la bande G a entraîné une diminution du rapport (ID/IG : 0,976), indiquant une forte interaction entre l'hybride BSA-rGO et le strontium. Les SrNP métalliques ont amélioré la structure désordonnée de BSA-rGO, ce qui a confirmé qu'il y avait une forte interaction avec la réticulation réussie du strontium dans les sites défectueux de BSA-rGO27. Les échantillons ont été préparés pour l'imagerie AFM par coulage en goutte sur la lame de verre et le solvant a été évaporé à température ambiante pendant une nuit. La figure 3b-g montre les différentes images AFM et les mesures de profil de hauteur. Selon le profil de hauteur des images AFM, l'épaisseur de BSA-rGO a dépassé l'épaisseur de GO, ce qui suggère que la BSA peut avoir été adsorbée sur rGO en tant que stabilisant par des interactions d'empilement hydrophobes et π-π. Une autre découverte était que l'épaisseur moyenne typique du nanocomposite Sr-BSA-rGO était plus significative que l'épaisseur moyenne typique de RGO attribuée à la présence de SrNPs sur la surface. L'augmentation de l'épaisseur des nanofeuilles de graphène après revêtement a déjà été rapportée. Par exemple, Upadhyay et al. ont rapporté que l'encensement dans l'épaisseur des nanofeuilles de GO de 1 à 110 nm, a été détecté lorsque le polyéthylène a été greffé à la surface de GO31. Dans un autre travail, la réduction et la décoration de nanofeuilles de GO avec de la polydopamine ont amélioré l'épaisseur des nanofeuilles de GO32. Auparavant, nous utilisions également un anticorps monoclonal nommé Herceptin pour synthétiser et marquer in situ des feuilles de graphène, et nous avons constaté une amélioration de l'épaisseur du graphène en introduisant un anticorps33.

Structure et morphologie des nanofeuillets. ( a ) Spectre Raman des nanofeuillets GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO. ( b – d ) Images AFM de nanofeuillets GO, BSA-rGO, Sr-BSA-rGO respectivement. (e – g) Le profil d'épaisseur de GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO respectivement.

Selon nos résultats, la valeur du potentiel zêta pour GO est de -28, 5 mV (Fig. 4). Cela est principalement dû aux groupes fonctionnels oxygène à la surface de GO et aux densités de charges négatives résiduelles. Cependant, la tension BSA-rGO diminue à -29,47 mV qui devient plus négative par rapport à GO. Il montre que BSA-rGO avait une dispersion aqueuse plus stable que GO, en raison des segments hydrophiles de BSA. Les SrNP avaient une valeur de potentiel zêta de -6 mV en raison de leur faible solubilité dans l'eau, tandis que le Sr-BSA-rGO représentait une valeur de potentiel zêta de -22, 03 mV. La différence entre BSA-rGO et Sr-BSA-rGO indiquait la bonne fixation du strontium métallique sur BSA-rGO. Malgré cette liaison, les nanofeuillets Sr-BSA-rGO avaient une valeur négative, indiquant une stabilité dans un environnement aquatique.

Potentiel zêta de GO, BSA, Sr, BSA-rGO (illustré par RGO) et Sr-BSA-rGO (illustré par RGO-Sr).

Pour confirmer l'assemblage des SrNPs à la surface des nanofeuillets BSA-rGO, nous avons utilisé FESEM. Comme le montre la figure 5, des SrNP sous forme dispersée et regroupée ont été déposés à la surface de nanofeuillets BSA-rGO. Nous avons également utilisé l'option d'électrons rétrodiffusés de FESEM pour une meilleure illustration des SrNP à la surface des nanofeuilles (Fig. 5b). Les SrNP ont été observés plus légers que les nanofeuilles de graphène. Selon la figure 5c, la taille des SrNP a été observée près de 20 nm et les SrNP possédaient une forme sphérique. Le spectre EDS de Sr-BSA-rGO a montré que l'apparition du strontium avec un pourcentage en poids de 10, 57% était une preuve claire de la décoration efficace des SrNP sur la grande surface de BSA-rGO (Fig. 5d). La dispersion des SrNPs à la surface de BSA-rGO a été surveillée par analyse des cartographies d'éléments. Le nanocomposite hybride contenait C, O, N et Sr comme composants principaux, et chaque élément était dispersé uniformément (Fig. 6), ce qui était conforme aux images FESEM.

Images FESEM de nanofeuillets Sr-BSA-rGO. (a) et (c) Image électronique secondaire. (b) Image électronique rétrodiffusée (les flèches jaunes révèlent les NP Sr). ( d ) Analyse EDS de nanofeuillets Sr-BSA-rGO.

( a – e ) Images de cartographie élémentaire des éléments C, N, O et Sr de Sr-BSA-rGO. (f) Image fusionnée du carbone et du strontium. (g) Image fusionnée du carbone et du strontium dans le FESEM.

La microscopie électronique à transmission (TEM) est une technique efficace pour déterminer la taille des grains, la distribution granulométrique et la forme des NP assemblées. Les figures 7a, b illustrent des images TEM de nanofeuillets GO et BSA-rGO16. Il n'y avait aucun signe d'agrégation dans les nanofeuilles GO après réduction avec BSA, et la figure représentait les nanofeuilles rugueuses qui avaient déjà été exfoliées, révélant une large surface pliée et une structure agglomérée. Ces images ont soutenu notre XRD et ont confirmé qu'il n'y a pas d'agrégation de nanofeuilles GO en présence de BSA. Les figures 7c, d ont démontré des amas de strontium bien dispersés et des NP monodispersés à la surface des nanofeuilles BSA-rGO). Les points noirs de la Fig. 7c, d affichaient les NP de strontium métallique cristallin qui étaient dispersés de manière identique à la surface de nanofeuilles de rGO froissées hydrophiles.

Images TEM des nanofeuillets (a) GO, (b) BSA-rGO et (c,d) Sr-BSA-rGO. Les points noirs dans les images TEM étaient des nanoparticules de Sr.

Nous avons étudié la cytotoxicité des nanofeuillets GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO à l'aide du test MTT. Comme le montre la figure 8a, les nanofeuilles GO ont réduit la viabilité des cellules MC3T3-E1 à 70, 55 et 47 % par rapport au témoin après incubation pendant 24, 72 et 120 h à une concentration constante (100 μg/ml), respectivement. Les pourcentages de viabilité cellulaire pour les incubations de 24, 72 et 120 h avec BSA-rGO étaient de 80, 70 et 75 %, respectivement. Les nanofeuilles BSA-rGO ont augmenté la viabilité des cellules par rapport à GO à la même concentration. Pour mieux étudier l'effet des nanofeuillets Sr-BSA-rGO sur la viabilité des cellules, nous avons utilisé différentes concentrations de nanofeuillets Sr-BSA-rGO (1, 10, 50, 100 μg/ml). Le pourcentage de viabilité cellulaire était supérieur à 80 % pour les cellules incubées avec différentes concentrations de nanofeuillets Sr-BSA-rGO. Ces nanofeuilles ont démontré la viabilité cellulaire la plus élevée par rapport à GO et BSA-rGO. La toxicité du GO a été largement étudiée et le GO avait une toxicité négligeable à des concentrations élevées. De plus, les nanofeuilles et les substrats recouverts de protéines avaient un grand potentiel pour améliorer la prolifération et la viabilité des cellules. Par exemple, Ahadian et al. ont rapporté une solution aqueuse de nanofeuilles de graphène en utilisant du BSA et du graphite capables d'augmenter la viabilité cellulaire et le taux de prolifération22. De plus, nous avons trouvé la viabilité cellulaire améliorée pour les groupes traités avec des nanofeuillets Sr-BSA-rGO à différentes concentrations. En raison de l'interaction non covalente des SrNP et des nanofeuillets de graphène, ils peuvent être libérés dans le milieu de culture. Les ions Sr avaient la capacité de stimuler la viabilité cellulaire, en particulier dans l'ingénierie du tissu osseux15.

Bilan biologique des nanofeuillets synthétisés. (a) Mesure de la viabilité cellulaire (test MTT) des cellules MC3T3-E1 traitées avec différentes concentrations de Sr-BSA-rGO (1, 10, 50, 100 μg/ml) et une concentration constante de GO et BSA-rGO (100 μg/ml) à différents temps d'incubation (24, 72 et 120 h). (b) Mesure de l'activité ALP des cellules MC3T3-E1 traitées avec une concentration constante de nanofeuillets GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO (100 μg/ml) à différents temps d'incubation (24, 72 et 120 h). Toutes les expériences ont été menées en triple (n = 3). ( c ) Effet de Sr-BSA-rGO sur la différenciation ostéogénique des cellules MC3T3-E1. Des nanofeuillets Sr-BSA-rGO ont été utilisés pour traiter les cellules MC3T3-E1 à 100 g/ml. ( d ) Après une période d'incubation de 24, 72 et 120 h, la RT-PCR a été utilisée pour détecter les niveaux d'expression de RUNX2 et Col 1A1, et leur normalisation a été effectuée contre GAPDH.

Ici, nous avons également étudié l'activité ALP de GO, BSA-rGO et Sr-BSA-rGO. La concentration de nanofeuillets était constante (100 µg/ml) et l'expérience a été suivie pendant 24, 72 et 120 h. Les nanofeuillets Sr-BSA-rGO ont stimulé l'activité ALP des cellules MC3T3-E1 par rapport à GO et BSA-rGO, cette tendance étant similaire pendant 72 et 120 h (Fig. 8c). La RT-PCR a été utilisée pour évaluer la différenciation ostéogénique du Sr-BSA-rGO induit par les cellules MC3T3-E1. Comme le montrent les figures 8b, d, le traitement avec 100 μg / ml de Sr-BSA-rGO a considérablement amélioré l'expression des gènes RUNX2 et Col1A1. Fait intéressant, une tendance similaire a été observée dans l'activité ALP et le test MTT. Après un traitement Sr-BSA-rGO pendant 120 h, les cellules MC3T3-E1 ont présenté le niveau d'activité ALP le plus élevé à la concentration de 100 μg/ml. Prises ensemble, ces expériences ont révélé que 100 μg/ml de Sr-BSA-rGO provoquaient les effets les plus prononcés sur la différenciation ostéogénique des cellules MC3T3-E1.

En bref, nous avons suggéré une approche simple pour la synthèse in situ médiée par BSA de nanofeuillets rGO décorés de Sr selon la réduction/décoration à base de protéines. Les spectroscopies UV-Vis, Raman, XRD et FTIR ont montré que la BSA avait un rôle principal dans la réduction et la décoration des SrNP à la surface des nanofeuilles de rGO. Les images SEM et TEM ont vérifié le dépôt de SrNP sur la surface proéminente de BSA-rGO. Après traitement avec des nanofeuillets Sr-rGO, les cellules MC3T3-E1 ont montré une activité ALP accrue par rapport à GO et BSA-rGO, cette tendance a été observée en 72 et 120 h de traitement, respectivement. Par rapport à GO et BSA-rGO, la cytotoxicité des nanofeuillets Sr-BSA-rGO dans une expérience MTT a montré la meilleure viabilité cellulaire. Après traitement de Sr-BSA-rGO pendant 120 h, les cellules MC3T3-E1 ont présenté le niveau de bioactivité le plus élevé à 100 μg/ml. Dans l'ensemble, cette étude a démontré que 100 μg/ml de Sr-BSA-rGO ont établi les impacts les plus notables sur l'ostéogenèse et la différenciation ostéogénique des cellules MC3T3-E1. Il semble que l'utilisation de nanobiomatériaux hybrides synthétiques puisse offrir une voie viable pour la fourniture de biomatériaux de substitution osseuse dans le cadre de la régénération tissulaire.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ces auteurs ont contribué à parts égales : Hossein Akbari et Esfandyar Askari.

École de génie chimique, Collège d'ingénierie, Université de Téhéran, Téhéran, Iran

Hossein Akbari & Zeinab Salehi

Groupe de recherche sur les biomatériaux et le génie tissulaire, Département des technologies interdisciplinaires, Centre de recherche sur le cancer du sein, Motamed Cancer Institute, ACECR, Téhéran, Iran

Esfandyar Askari

Département de nanotechnologie, École des technologies avancées, Université iranienne des sciences et technologies (IUST), PO Box 16846-13114, Téhéran, Iran

Esfandyar Askari & Seyed Morteza Naghib

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HA et EA ont effectué des procédures expérimentales. SMN et ZS ont supervisé, convaincu l'idée et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance avec Seyed Morteza Naghib.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Akbari, H., Askari, E., Naghib, SM et al. Le strontium décoré au graphène fonctionnalisé par l'albumine de sérum bovin en tant que nanoparticule complexe puissante pour l'ingénierie des tissus osseux. Sci Rep 12, 12336 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16568-7

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Reçu : 02 avril 2022

Accepté : 12 juillet 2022

Publié: 19 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-16568-7

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