Utilisation de la peroxydase

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 6953 (2022) Citer cet article

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Des nanoparticules d'argent stabilisées à la polyvinylpyrrolidone (PV-AgNPs) ont été synthétisées à partir d'AgNO3/citrate trisodique et à l'aide d'énergie micro-onde. Les PV-AgNPs synthétisés se sont avérés posséder une activité imitant la peroxydase. Cette activité catalytique peut oxyder le réactif non fluorescent (o-phénylènediamine) en un produit de réaction à haute fluorescence (2,3-diaminophénazine). Le produit de réaction présentait une émission de fluorescence à 563 nm lors de l'excitation à 420. Parmi de nombreux métaux, seuls les ions mercure (II) peuvent inhiber l'activité catalytique de la nanozyme PV-AgNPs. En conséquence, l'intensité de fluorescence du produit de réaction a été désactivée avec succès. Cet effet d'extinction de l'intensité de fluorescence était directement proportionnel à la concentration de mercure (II). En fonction de cette découverte, une approche spectrofluorimétrique simple, rentable et sélective a été conçue pour la détection du mercure (II) dans les échantillons d'eau. La relation linéaire entre l'inhibition de l'intensité de fluorescence et la concentration de mercure (II) a été trouvée dans 20–2000 nM avec une limite de détection de 8,9 nM.

Le mercure métallique est l'un des métaux lourds toxiques et largement répandus les plus connus en raison de ses effets nocifs lors de son accumulation dans le corps humain1. Il est largement distribué dans le sol, l'atmosphère et l'eau de mer par les activités humaines et les phénomènes naturels, causant de graves conséquences sur la plupart des organismes vivants et l'environnement2. Les principales sources de contamination par le mercure (II) des eaux de surface et des eaux usées sont la production de chlore-alcali, le papier et la pâte à papier, les raffineries de pétrole, les batteries et les processus de fabrication de peinture dans les industries3. En raison de sa grande affinité pour les groupes thiol présents dans les enzymes et les protéines, le mercure peut s'accumuler dans les tissus et les organes vitaux du corps humain, produisant des substances toxiques et nocives pour la santé humaine, même en faible quantité4. Certains symptômes et signes chroniques et aigus générés par la toxicité du mercure inorganique sont les suivants : inflammation de la bouche ; la soif; Goût métallique; nausée; salivation excessive; dégénérescence rénale et tremblement5.

La sélectivité et la sensibilité du chimiosensoriel utilisé pour détecter l'ion mercure (II) dans les échantillons d'eau est une demande essentielle. Par conséquent, le capteur utilisé doit être caractérisé par sa simplicité, son faible coût, sa haute sensibilité et sa sélectivité adéquate, qui peut détecter les ions mercure (II) dans des échantillons aqueux au niveau nanomolaire et sans interférences de la présence d'autres ions métalliques.

Les nanoparticules sont largement utilisées comme capteurs pour détecter les polluants environnementaux6,7,8,9. De nombreux chercheurs s'intéressent aux nanoparticules d'argent en raison de leurs caractéristiques optiques inhabituelles, de leur bande SPR et de leur taille ultrapetite10,11,12,13. Les nanoparticules d'argent sont également largement utilisées dans les industries des capteurs, du textile et du stockage des aliments en raison de leur excellente conductivité et de leur activité catalytique10,11,12,13,14,15. L'activité distincte et unique de type enzymatique des nanoparticules métalliques a suscité l'intérêt pour la catalyse de nombreuses réactions chimiques et applications d'analyse des métaux16.

Il existe de nombreux avantages à utiliser des nanoparticules comme imitateur d'enzyme / enzyme artificielle par rapport aux enzymes naturelles qui se concentrent sur l'absence des obstacles inhérents à l'enzyme naturelle. Ces obstacles comprennent la disponibilité fastidieuse et fastidieuse des ressources naturelles et le processus de purification coûteux ; sensibilité aux températures élevées, conditions de stockage rigoureuses, sensibilité aux conditions de pH alcalin et acide et aux protéases, entraînant une diminution de la stabilité réduisant la durée de conservation17,18. Les nanoparticules inorganiques imitant les enzymes sont dotées de certaines caractéristiques, notamment un faible coût, une stabilité élevée, une résistance aux concentrations élevées du substrat, une facilité de stockage et une facilité de synthèse19,20,21.

En général, les nanoparticules de métaux nobles (tels que l'or, l'argent, le platine et le palladium) présentent des caractéristiques physicochimiques attrayantes qui dépendent de leur forme et de leur taille6,16. Par exemple, l'activité catalytique de type peroxydase des nanoparticules d'or a été utilisée pour la détection colorimétrique du mercure (II) et des ions plomb dans des échantillons d'eau22,23. De plus, l'activité catalytique des nanoparticules de platine a été utilisée pour détecter les ions mercure (II) dans des échantillons d'eau24,25. En outre, l'activité catalytique des nanoparticules d'argent a été utilisée pour la détection colorimétrique visuelle des protéines et comme capteur de diffusion Rayleigh par résonance pour la détection des ions mercure (II)26,27,28. L'activité catalytique de ces nanomatériaux dépend de leur taille, appelée « effet taille » ; par exemple, la grande activité catalytique des nanoparticules d'or peut être observée avec des tailles nano inférieures à 5,0 nm 16,29,30. Pour cette raison, de nombreux efforts ont été consacrés à la réduction de la taille des nanoparticules synthétisées31.

Les études rapportées prouvent que l'utilisation d'un tensioactif polyvinylpyrrolidone pour préparer des Ag-NP produit de minuscules nano-tailles inférieures à 10 nm et stabilise les nanoparticules formées pendant une longue période32,33. De plus, l'énergie d'irradiation par micro-ondes par rapport au chauffage conventionnel provoque un chauffage uniforme et rapide de la solution. Il produit ainsi des sites de nucléation homogènes dans les conditions de solution et de croissance, provoquant des nanoparticules monodispersées en un temps court34. De plus, l'irradiation par micro-ondes peut bénéficier d'une bonne distribution granulométrique et de tailles de particules plus petites pour synthétiser des nanoparticules d'argent35.

Le spectromètre à fluorescence est une technique analytique très sensible qui offre généralement une grande sélectivité sans perte de précision36,37,38. La conception d'un capteur fluorescent pour la détection des ions mercure (II) reposant sur la propriété de type peroxydase des nanoparticules d'argent n'a pas encore été étudiée. Par conséquent, ce travail vise à utiliser l'activité catalytique des nanoparticules d'argent stabilisées à la polyvinylpyrrolidone de plus petite taille comme nanozyme pour la détection par fluorescence des ions mercure (II).

La O-phénylènediamine, la polyvinylpyrrolidone et le nitrate d'argent ont été produits par Sigma-Aldrich Chemical Co (Steinheim, Allemagne).

Le nitrate d'aluminium, le chlorure de baryum, le chlorure de cadmium, le chlorure de chrome, le nitrate de cobalt, le chlorure de calcium, le chlorure de magnésium, le peroxyde d'hydrogène, le chlorure mercurique, le nitrate de nickel, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium et le nitrate de zinc ont été produits par El-Nasr Chemical Co. (Le Caire, Égypte). Le citrate trisodique a été produit par Fisher Scientific Co. (Leicestershire, Royaume-Uni). De l'eau ultra pure a été utilisée dans toutes les étapes expérimentales.

Les spectres de fluorescence ont été réalisés sur un spectromètre fluorescent FS2 (Scinco, Corée). La morphologie des nanoparticules d'argent préparées a été caractérisée par JSM 5400 LV SEM (JEOL, Tokyo, Japon). La taille nanométrique, l'indice de dispersion poly et la qualité des nanoparticules d'argent préparées ont été caractérisés par ZEN 1690 (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Un four à micro-ondes SM-2000MW (Smart Co., Chine) a été utilisé pour le processus de chauffage.

Une solution de PVP à 0, 2% p / v, une solution de citrate trisodique 10 mM et une solution de nitrate d'argent 10 mM ont été simultanément versées dans un flacon de 250 ml dans le rapport de 0, 5: 1: 1 et mélangées par agitation magnétique pendant 3 min. Le ballon a été chauffé pendant environ 12 min à 90 ° C par irradiation aux micro-ondes. La formation de nanoparticules d'argent polyvinylpyrrolidone (PVP-AgNPs) peut être mise en évidence par la transformation de la solution incolore en un état colloïdal vert jaunâtre.

Dans une série de flacons calibrés (10 mL), des volumes appropriés de solutions de mercure (II) (de l'ordre de 100 nM à 20 µM) et 800 µL de solution PVP-AgNPs ont été versés, incubés pendant 2 min et suivis de l'ajout de 800 µL de solution d'O-phénylènediamine (préparée en dissolvant 0,108 g dans 100 mL d'eau). Ensuite, 400 µL de solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % p/v ont été ajoutés au contenu, et le contenu a été vortexé pendant 1 min. Après 15 min d'incubation à température ambiante, le volume a été complété à 10 mL par de l'eau déminéralisée. La solution à blanc a été préparée simultanément par les mêmes étapes en omettant l'ajout de solution de mercure (II). L'extinction de l'intensité de fluorescence de la solution à blanc lors de l'ajout de mercure (II) a été mesurée à la \({\lambda}_{émission}\) de 563 nm, à la \({\lambda}_{excitation}\) de 420 nm. La spécificité de la méthode suggérée a été vérifiée par l'ajout de différentes solutions d'ions métalliques à la concentration de 10 µM au lieu de l'ion mercure (II) dans les procédures susmentionnées.

Des échantillons d'eau du robinet et d'eau en bouteille ont été prélevés dans notre laboratoire et dans un établissement local. Les échantillons recueillis ont été dopés avec différentes concentrations connues de mercure (II). Ensuite, les échantillons d'eau ont été filtrés à l'aide d'un filtre à seringue de 0,45 μm pour éliminer toute matière particulaire. Enfin, le test analytique général mentionné ci-dessus a été suivi.

La morphologie et les caractéristiques élémentaires [taille des particules, indice de polydispersité (PDI), taille uniforme] des PVP-AgNPs ont été examinées à l'aide d'un appareil SEM et d'un appareil zêta-sizer, respectivement. La figure 1 montre l'image SEM de PVP-AgNPs, qui fait référence à la forme sphérique en forme de tige du nanomatériau synthétisé. La taille mesurée des PVP-AgNPs synthétisés était de 5, 5 nm avec une taille uniforme, une bonne qualité et une faible valeur d'indice de polydispersité de 0, 440 Fig. 1A. La taille des nanoparticules est le principal facteur responsable de leur activité catalytique39. Généralement, la performance catalytique des nanoparticules d'argent est inversement proportionnelle à la nanotaille de leurs particules40. Dans l'étude actuelle, la taille déterminée des PVP-AgNPs préparés est très petite (5,5 nm), ce qui fait référence à leur activité catalytique supérieure.

(A) Taille de caractérisation, valeur PdI et qualité des PVP Ag-NPs synthétisés par le dispositif zeta-sizer ; (B) Caractérisation de la morphologie des PVP Ag-NPs synthétisées par dispositif SEM.

L'O-phénylènediamine (OPD) est l'un des substrats typiques utilisés pour étudier l'activité de type peroxydase des nanoparticules25,41. L'OPD (incolore et non fluorescent) a été oxydé par la peroxydase imitant l'activité de certaines nanoparticules en 2,3-phénazinediamine (colorée et fluorescente)25. Ici, l'activité imitant la peroxydase des PVP-AgNPs préparés a été examinée par la technique de fluorescence et la technique spectrophotométrique utilisant le système OPD/H2O2. Pratiquement, l'activité catalytique des PVP-AgNPs préparés a été confirmée par spectrophotométrie par l'apparition d'un pic d'absorbance caractéristique à λmax = 420 nm, Fig. 2. De plus, elle a été mise en évidence par fluorimétrie par l'existence d'un pic de fluorescence distinct à λémission = 563 sur λexcitation = 420, Fig. 2. De plus, il a été constaté que seul le mélange de PVP-AgNPs/OPD/H2O2 présentait cette comportement fluorescent. En revanche, aucun des mélanges PVP-AgNPs/OPD, OPD/H2O2 et PVP-AgNPs/H2O2 n'a produit de caractère de fluorescence dans les mêmes conditions. Ces valeurs de pic d'absorbance et de pic d'émission de fluorescence correspondent à celles de la 2,3-phénazinediamine qui ont été rapportées dans des études de la littérature25.

Examen de l'activité imitant la peroxydase pour les PVP-Ag-NPs préparés en formant les spectres caractérisés d'absorption et de fluorescence (excitation/émission) du produit de réaction OPDA (2,3-phénazinediamine).

Il est bien connu que la 2,3-phénazinediamine colorée, qui possède un comportement fluorescent distinctif à λémission = 563 nm/λexcitation = 420 nm, est le produit oxydé de l'o-phénylènediamine. Initialement, la solution incolore est passée de non fluorescente à une solution jaune fluorescente brillante lorsque les PVP-AgNPs ont été ajoutés au système o-phénylènediamine/H2O2. Dans cette réaction, les PVP-AgNPs préparés possédaient une activité imitant la peroxydase qui peut catalyser l'oxydation de l'o-phénylènediamine avec H2O2 pour donner la 2,3-phénazinediamine comme produit de réaction principal.

Mercure a un avantage unique sur le reste des éléments grâce à sa capacité à former un amalgame avec certains éléments tels que l'or, le platine et l'argent24,25,27,28,42,43. Par conséquent, dans cette étude, la formation d'amalgame Ag – Hg produit une inhibition efficace de l'activité catalytique des PVP-AgNPs, combinée à une modification de leurs propriétés de surface. Cet effet d'inhibition catalytique des PVP-AgNPs empêche la transformation du système OPD/H2O2 en 2,3-phénazinediamine. En conséquence, une action d'extinction sur l'intensité de fluorescence de la solution lors de l'ajout de mercure (II) par rapport à l'intensité de fluorescence de l'échantillon blanc (sans Hg2+), Fig. 3. Par conséquent, la détermination sélective du mercure (II) dans une certaine plage de concentration linéaire a été réalisée. Le mécanisme de détection du mercure (II) est illustré dans le schéma 1.

(A) pour les spectres de fluorescence (excitation et émission) du système OPD/H2O2/PVP-Ag-NPs (a, b, respectivement) et après leur trempe par 1,0 µM de Hg2+ (c, d), tandis que (B) pour les spectres de fluorescence du système OPD/H2O2/PVP-Ag-NPs en présence de diverses concentrations de Hg2+.

Élucidation schématique pour la détection du mercure (II) par technique spectrofluorimétrique.

Les conditions de réaction impliquant le volume de H2O2, le temps de réaction, le volume d'OPDA et le volume de PVP-Ag-NPs ont été examinés et optimisés pour trouver les conditions optimales d'analyse. Le système de détection a été incubé avec du mercure (II) pendant 15 min et les conditions optimales pour l'extinction de l'intensité de fluorescence de la solution (par rapport à la solution à blanc) ont été obtenues avec 800 µL de suspension PVP-AgNPs, 800 µL de solution OPD et 400 µL de solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % p/v, Fig. 4. Cet effet d'extinction de l'intensité de fluorescence de la solution est directement proportionnel à la concentration de mercure (II).

Étude du volume de réactifs pour la détection de Hg2+ (1,0 µM) par la méthode suggérée.

La relation linéaire entre l'extinction de l'émission de fluorescence à 563 nm et la concentration de mercure (II) a été établie dans la plage de 20 nM à 2 μM avec l'équation de régression de \(y=0,1352x +13,51\), la valeur R2 de 0,998 et la valeur LOD de 8,9 nM (S/N = 3, où N représente le bruit et S représente la sensibilité). Les paramètres statistiques pour détecter Hg2+ par la méthodologie de fluorescence sont présentés dans le tableau 1. D'autres métaux communs tels que Al3+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, K+, Mg2+, Ni2+, Na+ et Zn2+ ont été testés par la méthodologie fluorescente actuelle pour étudier la sélectivité du système de détection de conception. Il a été constaté qu'aucun effet évident sur l'intensité des émissions du système PVP-AgNPs/OPD/H2O2 n'a été détecté lors de l'ajout de tout métal à partir des métaux mentionnés à un niveau de concentration plus élevé (excès de dix fois par rapport au mercure (II)). En revanche, l'intensité d'émission de PVP-AgNPs/OPD/H2O2 a été significativement diminuée en présence de mercure (II), ce qui fait référence à la bonne sélectivité pour le système fabriqué (Fig. 5). L'explication de la parfaite sélectivité de la méthode proposée pour le mercure (II) peut être attribuée à la formation d'amalgame Ag-Hg par une interaction spécifique entre les nanoparticules d'argent et l'ion mercure (II)42.

Examen de la sélectivité du système utilisé (OPD + H2O2 + PVP-Ag-NPs) pour la détection de l'ion Hg2+ (1 µM) en présence d'ions de métaux communs (10 µM).

Les applications de PVP-AgNPs pour les expériences d'échantillons dopés ont été réalisées avec des échantillons d'eau du robinet et des échantillons d'eau en bouteille. Pour évaluer le caractère pratique de l'application de la méthodologie fluorescente dans des échantillons d'eau du robinet et des échantillons d'eau en bouteille ont été dopés avec du mercure (II) à différents niveaux de concentration et testés par la méthodologie suggérée. Les données du tableau 2 se réfèrent à la bonne récupération et aux valeurs SD pour la détermination des ions mercure (II) par la méthode actuelle. Ces valeurs SD et de récupération ont mis en évidence la validité de l'exactitude et de la précision de la méthodologie présentée pour la détection du mercure (II) dans les échantillons d'eau du robinet et les échantillons d'eau en bouteille.

Dans cette étude, l'énergie d'irradiation par micro-ondes a été utilisée pour aider à la synthèse de nanoparticules d'argent stabilisées à la polyvinylpyrrolidone avec de très petites tailles nanométriques. Les nanoparticules d'argent préparées ont montré un comportement d'activité peroxydase distinctif. Sur la base de l'effet d'inhibition des ions mercuriques (II) vis-à-vis de cette activité peroxydase des nanoparticules d'argent préparées, une méthodologie fluorescente avec une réponse hautement sensible et extrêmement sélective vis-à-vis de la détection des ions mercuriques (II) a été établie. Dans les conditions optimales, le test fourni présentait une limite de détection (LOD) de 8,9 nM avec une plage linéaire de 20 à 2 000 nM. La méthodologie actuelle offrait certains avantages en ce qui concerne la verdeur de la synthèse, la petite taille des particules, la bonne stabilité et l'uniformité, l'utilisation d'une concentration plus faible du nanozyme et la facilité de détection.

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Département de chimie analytique pharmaceutique, Faculté de pharmacie, Université Al-Azhar, Assiut Branch, Assiut, 71524, Égypte

Mohamed A. Abdel-Lateef

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Le manuscrit a été préparé par MA-L.

Correspondance à Mohamed A. Abdel-Lateef.

L'auteur ne déclare aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Abdel-Lateef, MA Utilisation de l'activité de type peroxydase du nanozyme de nanoparticules d'argent sur le système O-phénylènediamine/H2O2 pour la détection par fluorescence des ions mercure (II). Sci Rep 12, 6953 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10779-8

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Reçu : 18 janvier 2022

Accepté : 11 avril 2022

Publié: 28 avril 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-10779-8

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